ПОДБОР И ОЦЕНКА ИНФОРМАТИВНОСТИ ISSR-МАРКЕРНЫХ СИСТЕМ У ЛОШАДЕЙ

Куриленко Ю.Ф., Супрун И.А., Костенко С.А.

Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины Киев, Украина

Введение. Мониторинг генетического полиморфизма популяций является одной из важных составляющих программ сохранения и воспроизводства различных сельскохозяйственных видов, в том числе лошадей. Метод амплификации межмикросателлитних фрагментов ДНК позволяет оценить биологическое разнообразие путем анализа участков ДНК, расположенных между двумя инвертированными SSR-локусами генома (ISSR-PCR) [1, 4 ,5, 9]. По сравнению с другими методами мультилокусного профилирования метод ISSR-PCR характеризуется лучшей воспроизводимостью и эффективно используется для выявления внутривидовой и межвидовой генетической изменчивости, идентификации видов и популяций [10,11].

С этой целью проведен поиск полиморфных ISSR-маркеров для изучения генетического разнообразия популяций лошадей двух видов (Equus caballus и Equus przewalskii).

Цель работы - подбор информативных маркерных систем для ISSR-типирования в коневодстве.

Материал и методика исследований. Для проведения исследований были отобраны образцы биологического материала у 176 представителей 7 популяций лошадей (арабская, орловская рысистая, тракененская, новоалександровский тяжеловоз, чистокровная верховая, украинская верховая породы, лошади Пржевальского). Геномную ДНК выделяли из волосяных фолликулов лошадей с собственными модификациями [2] с помощью комплекта реактивов «ДНК-сорб В» (АмплиСенс, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Начальный этап лизиса проводили в течение 2 часов при 650С.

Концентрацию ДНК и степень ее чистоти определяли с помощью прибора NanoDrop. Амплификацию проводили на амплификаторе "Терцик" (Россия) в следующем температурном режиме: начальная денатурация - 4 мин при температуре 94 С; 32 цикла: 30 с при 94 °С, 30 с при 58 °С, 2 минут при 72 °С; 5 минут при 72 °С.

Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 67 мM Tris-HCl (pH 8,8), 17 мM (NH4) 2SO4, 0,01% Tween-20, 0,2 мМ дНТФ, 1,0 ед. Tag-полимеразы, 40-80 нг ДНК, 1,5-1,8 мМ MgCl2 и 0,4-0,5 мкМ праймера. Оптимальную концентрацию каждого из компонентов реакции подбирали экспериментально.

Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в 1,5%-ном агарозном геле, используя 0,5 х ТВЕ-буфер при постоянном напряжении 100 В в течение 80 минут. После окончания электрофореза гель обрабатывали бромистым этидием (0,5 мкг / мл), визуализировали под УФ-лучами и фотографировали цифровой камерой Panasonic DMC-FS42. Для определения молекулярной массы использовали маркер GeneRuler 100 bp ("Fermentas", Литва).

Результаты исследований и их обсуждение. Праймеры, которые были избраны нами для проведения исследований на начальных этапах запланированной работы и отвечали требованиям получения спектров ампликонов высокой воспроизводимости и специфичности для оценки межпородной дифференциации, генетической гетерогенности популяций, были использованы рядом авторов на других биологических объектах сельскохозяйственного назначения [5,6,8]: S1 - CTC)6A, S2 -(AGC)6G, S3 - (TCG)6G, S4 - (CTC^C, S5 - (GAG^G, S6 - (GTG)<A S7 - (CCA)6G, S8 - (GCT)6A, S9 - (AGC^C, S10 - (ACC^G.

В исследованиях некоторых авторов [3,7] выявлено, что использование праймеров к трехнуклеотидным микросателлитным повторам позволяет получить спектр с большим количеством фрагментов, в том числе и полиморфных по сравнению с динуклеотидными.

Согласно анализа данных, полученных при использовании метода ISSR-PCR нами был сделан вывод о существовании универсальных праймеров, способных к выявлению генетического полиморфизма не только на уровне различных видов, но и других таксономических единиц. Таким универсальным праймером ПЦР-анализа является фрагмент микросателлитных локусов с коровой последовательностью (AGC) на основе которого были созданы праймеры S2 и S9, оказавшиеся пригодными к определению внутри- и межпородного полиморфизма генома лошадей.

На первом этапе нашей научной работы проведен скрининг 10-ти маркерных систем на основе трехнуклеотидных праймеров с различными коровами последовательностями и якорными нуклеотидами на З'-конце (табл. 1).

Таблица 1. Характеристики использованных праймеров

168

Низкие значения PIC (polimorphic index content) при типировании по САС маркерам у лошадей, полученные Воронковой В.Н. (2011) [7] позволили нам исключить эту коровую последовательность из перечня проанализированных нами праймеров. В тоже время в исследованиях данного автора при ISSR-типировании лошадей наилучшим образом зарекомендовали себя GAG и АСС маркеры.

Спектры амплификации продуктов ISSR-PCR, полученные в результате первоначального скрининга праймеров, имели следующие характеристики: отсутствие ампликонов, диффузные спектры без четких дискретных полос и спектры с четкими ПЦР-продуктами (рис. 1).

169

Рис. 1 Скрининг ISSR-праймеров с трехнуклеотидними коровими последовательностями: М - маркер молекулярных размеров

По результатам проведенного скрининга праймеры S3 и S8 оказались непригодными для оценки генетического полиморфизма, поскольку не воспроизводили ПЦР - продукта. Объяснить это можно отсутствием в геноме исследованных лошадей микросателлитных локусов с таким количеством повторов или особенностью их образования и эволюции (наличие несовершенных повторов). Для праймеров S1 и S5 были характерны диффузные спектры без четких дискретных полос. Ввиду того, что ПЦР позволяет эффективно амплифицировать локусы, расстояние между которыми составляет не более 3 тыс. п.н., такая картина может свидетельствовать о расположении инвертированных локусов на большем расстоянии друг от друга. Отсутствие дискретных полос при электрофоретическом разделении может быть связано также с большим количеством этих микросателлитов в геномах.

С использованием праймеров S2, S4, S6, S7, S9, S10 были получены четкие зоны амплификации. Однако в дальнейшем для оценки внутривидового полиморфизма лошадей мы применяли маркерные системы (S2, S6, S9, S10), имеющие сравнительно большее количество локусов. Общее количество ампликонов варьировало в зависимости от микросателлитных последовательностей праймера и якорного нуклеотида.

При повторной амплификации геномной ДНК одного и того же животного не всегда воспроизводится весь спектр продуктов амплификации. Для анализа использовали только четкие ПЦР - локусы которые воспроизводились не менее чем в 3 -4 независимых экспериментах. Диффузные, низкомолекулярные фрагменты длиной 80-150 п.н., которые не воспроизводились при повторных экспериментах, нами не учитывались. Каждый продукт амплификации рассматривали как отдельный локус.

Всего при использовании 4 ISSR - праймеров было получено 74 продукта амплификации ДНК лошадей, 54 из которых (72,97 %) были полиморфными (табл. 2.).

Таблица 2. Общая характеристика ISSR-ампликонов лошадей

170

Общее количество ПЦР-локусов вариировало от 24 (для праймера (АСС) 6G) до 14 (для праймера (GTG) 6А), количество полиморфных локусов от 19 ((АСС) 6G) до 9 ((AGC) 6С). Примеры полученных спектров амплификации приведены на рисунках 2-3.

Весь спектр продуктов амплификации разделили на 3 части: область «тяжелых» фрагментов (более 1000 п.н.), включавшая в себя наиболее длинные фрагменты ДНК; область ампликонов среднего диапазона (500-1000 п.н.) и наиболее короткие низкомолекулярные фрагменты размером 300-500 п.н. При использовании праймера (АСС) 6G получено наибольшее общее количество ПЦР-бэндов, наибольшее количество полиморфных ампликонов - 24 и 19 соответственно и высокий уровень полиморфизма (79,17%) среди всех использованных в работе ISSR-праймеров. Длина полученных продуктов ПЦР находилась в диапазоне от 260 до 1430 п.н. В спектрах праймера (АСС) 6G преобладали продукты ПЦР со средним размером 500-1500 п.н. -63,16%, доля низкомолекулярных ампликонов размером менее 500 п.н. составила 36,84%.

171

Рис. 2. Электрофореграмма разделения продуктов амплификации -PCR лошадей за использование праймеров (АСС) 6G (1-7) и (ДОС) 6G (8-14): М - маркер молекулярных размеров (GeneRuler DNA Ladder Mix, Fermentas), 1, 8 - арабская, 2, 9 - лошади Пржевальского, 3, 10 - орловская рысистая, 4, 11 - тракененская, 5, 12 - новоалександровский тяжеловоз, 6, 13 - чистокровная верховая, 7, 14 - украинская верховая порода.

При использовании праймера (AGC) 6G с ДНК лошадей различных пород получено 19 продуктов амплификации, 15 из которых (76,47%) были полиморфными. Длина ампликонов составляла 270 п.н. - 1400 п.н. Подавляющее большинство ПЦР-локусов, полученных с этим праймером, были среднего размера, что составляло 83,33% от общего количества локусов. Четыре ПЦР-локуса были длиной менее 500 п.н. (16,67%).

В мультилокусних спектрах амплификации праймера (GTG) 6А было получено 14 воспроизводимых ПЦР продуктов размером от 300 п.н. до 1120 п.н., 11 из которых оказались полиморфными и имели длину, соответствующую среднему диапазону. Таким образом, уровень полиморфизма для спектров с этим праймером и доля ПЦР- локусов среднего диапазона (11) составили 78,57%. Одним из наиболее распространенных показателей информативности маркеров, полученных при использованиии того или иного ПЦР-метода, является маркерный индекс (МкИ). Этот показатель позволяет учитывать мультилокусность спектров амплификации ДНК фингерпринту с использованием полимеразной цепной реакции.

172

Рис. 3 Электрофореграмма разделения продуктов амплификации ISSR-PCR с ДНК лошадей за использование праймеров (GTG) 6А (1-7) и (AGC) 6С (8-14), 1, 8 - арабская, 2, 9 - лошади Пржевальского, 3, 10 - орловская рысистая, 4, 11 - тракененская, 5, 12 - новоалександровский тяжеловоз, 6, 13 - чистокровная верховая, 7, 14 - украинская верховая порода

Наименьшее количество полиморфных ампликонов (9) и низкое значение маркерного индекса (2,5) получено с праймером ( ДОС ) 6C, уровень полиморфизма составил 46,67 %. Всего при использовании этого праймера ISSR - спектры состояли из 17 продуктов ПЦР длиной 420-1450 н.п. Как и в случае предыдущего праймера, подавляющее большинство ПЦР - локусов (15) имели средний размер (500 -1500 п.н.), что составило 88,24 % от общего количества локусов. Доля локусов с наименьшими размерами до 500 п.н. составила 11,76 %.

Анализ спектров продуктов амплификации участков между инвертированными повторами микросателлитных локусов осуществляли при использовании трехнуклеотидних праймеров с последовательностями: (ACC) 6О, (ДОС) 6G, (GTG) 6A и (ДОС) 6С. Следует отметить, что для всех протестированных праймеров ((ACC)6G, (AGQ6G, (GTG)6A и (AGC)6C) не обнаружены воспроизводимые ампликоны с размером более 1500 п.н. Значение маркерного индекса варьировало в зависимости от праймера. Высокие значения маркерного индекса получили для праймеров (ACC) 6О (5,7) и (АОС) 6О (3,9), что свидетельствует о большей информативности данных ISSR - праймеров для дифференцирования исследованных популяций лошадей. Для других двух праймеров величина МкИ была достоверно ниже ( р < 0,05, табл. 2).

Заключение. Таким образом, установлено, что количество продуктов амплификации (спектры ампликонов) и их полиморфизм значительно варьируют в зависимости от корового мотива микросателлитов, используемого в качестве праймера. ISSR-S2 и S10 системы являются наиболее информативными для анализа полиморфизма ДНК лошадей, по которым амплифицируется около 20 локусов генома и наблюдается межпородная и внутрипородная дифференциация.

ЛИТЕРАТУРА

1. Bornet B. Highly informative nature of inter simple sequence repeat (ISSR) sequences amplified using triand tetra-nucleotide primers from DNA of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis L.) / B. Bornet, С. Muller, F. Paulus, M. Branchard // Genome. - 2002. -V. 45. - P. 890-896.

2. Carter M. J., Milton I. D. An inexpensive and simple Korbin M. Fruit plant germplasm characterisation using molecular markers generated in RAPD and ISSR-PCR / M. Korbin, A. Kuras, E. Zurawicz // Cell. Mol. Biol. Lett. - 2002. - V 1. - P. 785-794.

3. Kuhl D.P.A. Trinucleotide repeats and genome variation / D.P.A. Kuhl, C.T. Cas-key // Curr Opin Genet. Dev. - 1993. - V. 3. - P. 404-407.

4. Zietkiewicze Е. Genome finger-printing by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reactmn amplification / Е. Zietkiewicze, A. Rafalski, D. Labuda // Genomics.

- V.20. - 1994. - P. 176-183.

5. Бардуков Н. В. Профили ДНК-маркеров (ISSR-PCR) у лошадей рысистых пород / Н. В. Бардуков, Г. К. Коновалова, В. И. Глазко // Изв. ТСХА. - 2010. - № 6. - С. 152

- 157.

6. Березовская О.П. Внутри- и межвидовые различия в ISSR-PCR характеристике шмелей (HYMENOPTERA: BOMBINAE) / Березовская О.П., Мороз О.Ю., Сидоренко А.П. // Цитология и генетика. - 2002. - T. 36, № 3. - С. 28-35.

7. Воронкова В. Н. Сравнительный анализ информативности ISSR-маркеров для оценки генетического разнообразия пород лошадей / В. Н. Воронкова, Цэндсурэн Цэдэв, Г. Е. Сулимова // Генетика. - 2011. - Т.47 - № 8. - С. 1131 - 1134.

8. Глазко В.И. Введение в ДНК технологии и биоинформатику: [под ред. Т.Т. Глазко] / В.И. Глазко, Г.В. Глазко - К.: 2001. - 544c.

9. Применение межмикросателлитного анализа ДНК для оценки популяционной структуры, идентификации и сходства генофондов пород и видов доместицированных животных / Ю. А. Столповский, О. Е. Лазебный, К. Ю. Столповский [и др.] // Генетика. -2010. - Т.46 - № 6. - С. 825 - 833.

10. Феофилов А. В. Дифференциация генофондов алтайской и рысистых пород лошадей по ISSR-PCR маркерам / А. В. Феофилов, Н. В. Бардуков, В. И. Глазко // Генетика. - 2011. - Т.47 - № 9. - С. 1230 - 1235.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021