ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ У СВИНЕЙ С ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

Кузьмич Р.Г., Багрецов В.Ф., Конотоп Д.С.

Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия  ветеринарной медицины

Любая патология животного является причиной или следствием иммунологических нарушений, которые способствуют переходу основ-ного заболевания в хроническое и его осложнениям. Необходимо иметь в виду, что иммунная система больных животных ослаблена патогенным действием самих инфекционных агентов, а также в результате лечения антибиотиками и противовирусными препаратами. Часто иммунологи-ческая недостаточность возникает вследствие какого-либо заболевания, беременности или старения организма [4]. При беременности в организ-ме матери происходит частичная имммунодепресия, связанная с угнете-нием клеточно-опосредованного иммунитета, необходимого для нор-мального вынашивания плода. Все чаще причиной этого является попа-дание в организм матери вирусов или внутриклеточных микроорганиз-мов. Эти возбудители могут наносить вред не только здоровью матери, но и угрожают внутриутробному развитию плода, являясь причиной спонтанных абортов, преждевременных родов, а также гибели ново-рожденных. [2].

Одной из таких инфекций является герпесвирусная инфекция сви-ней, протекающая чаще всего бессимптомно. Герпетические инфекции у беременных относятся к числу самых распространенных заболеваний, определяющих внутриутробное инфицирование, эмбрио- и фетопатии, акушерскую патологию. В последние годы отмечена тенденция к увели-чению инфицирования беременных вирусом простого герпеса и способ-ностью герпесвирусной инфекции, при определенных условиях, к энде-мическому распространению.

Характерных клинических признаков при данной болезни не от-мечается, однако выявлено ряд закономерностей. Так нами установлено, что среди свиноматок с нарушением воспроизводительной функции, процент серопозитивных животных составлял 34-36%. Чаще всего у данных животных регистрировали прохолосты; также отмечали мало-плодие, иногда аборты и эндометриты. У серопозитивных свиноматок процент рождения слабых и мертворожденных поросят выше, в 1,96 и 1,55 раз соответственно, чем у серонегативных маток [2,3].

Многие микроорганизмы являются слабыми иммуногенами, то есть гуморальный ответ (продукция к микроорганизму аутоантител) на них развивается недостаточно. Поэтому при персистирующих, латент-ных инфекциях, вызванных атипичными микроорганизмами или виру-сами, когда возбудитель не размножается и не выходит из клеток, анти-тел может не быть [1].

Особенностью патогенеза герпесвирусов является быстрый пере-ход возбудителя в организме в «латентное состояние». Герпесвирусы с целью маскировки от иммунокомпетентных клеток макроорганизма, ис-пользуют мембранную мимикрию, т.е. формируют дополнительную оболочку вириона из мембранных элементов использованной клетки. В результате этого иммуноглобулины класса M и G вырабатываются в не-большом количестве, поэтому наличие  антител свидетельствует, в большей степени, лишь о проникновении вируса в организм. При этом наличие вируса в организме  не обязательно гарантирует выработку до-статочного  количества антител для его инактивации, а также для диа-гностики заболевания. В то же время, при первичном попадании вируса сразу активизируются факторы клеточного иммунитета. При герпесви-русной инфекции наблюдается лимфоцитоз, увеличивается содержания Т-супрессоров, а также происходит снижение абсолютного количества Т-хелперов, соотношение хелперы/ супрессоры часто составляет 2:1.

Важное значение в регуляции иммунного ответа принадлежит си-стеме супрессии. Данная система предотвращает доминирование одного клона лимфоцитов над другими. Супрессия сопровождается специфиче-ским и неспецифическим угнетением антигена специфических хелперных  клеток. Т-хелперы активизируют развитие иммунного ответа в рамках Т-системы иммунитета и являются помощниками В-клеток в развитии гуморального иммунитета. При отсутствии Т-хелперов В-система лим-фоцитов  оказывается неспособной к развитию полноценного иммунного ответа. Т-супрессоры являются связующим фактором между клеточной и гуморальной системами иммунитета, так как действуют и на Т- и В-лимфоциты [1]. Т-лимфоциты-хелперы разделяются на два типа в зави-симости от секретируемых цитокинов: Th-1 и Th-2. Th-1-клетки ответ-ственны за появление цитотоксических Т-лимфоцитов, секретируют ин-терлейкин-2, интерферон, стимулирующие процессы клеточного имму-нитета. Интерлейкин-2 – является важным ростовым фактором для раз-личных популяций Т-клеток. Th-2-клетки выделяют Интерлейкины-4, -5, -6 и -10, которые индуцируют синтез антител и тормозят реакции кле-точного иммунитета.

Цитокины Th-1 и Th-2 происхождения находятся в антагонистиче-ских позициях по отношению друг к другу, их количество напрямую за-висит от количества Т-хелперов. В норме соотношение Т-супрессоров и Т-хелперов составляет 1:3. В большом количестве, Т-супрессоры подав-ляют действие Т-хелперов, что может привести к ослаблению их функ-ции и развитию имммунодефицитных состояний. Поэтому в нарушении функции Т-супрессоров необходимо искать причины многих видов им-мунопатологии.

Иммунные реакции играют существенную роль в развитии патоге-неза, клинических проявлениях различных заболеваний вирусной этио-логии и реактивации латентно протекающих инфекций, в том числе гер-песвирусной инфекции свиней. Оценка состояния Т-клеточной системы иммунитета важна для прогнозирования течения инфекции и оценки эф-фективности проводимого лечения. Учитывая все это, возникает необхо-димость использовать методы диагностики иммунного статуса, особенно функциональное состояние различных субпопуляций Т-лимфоцитов, в дополнении к основным алгоритмам исследования.

В последние годы предложен ряд методов по определению относи-тельного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, по морфологи-ческим и функциональным признакам. По морфологическим признакам обычно дифференцируют общее количество Т- и В-лимфоцитов. Для определения функционального состояния чаше используют тест розет-кообразования. Это классический метод определения количества Т-лимфоцитов в периферической крови основан на наличии на мембране Т-лимфоцитов всех субпопуляций рецепторов к эритроцитам барана и способности Т-лимфоцитов образовывать с ними прочные комплексы (так называемые розетки) [4]. Данный метод удобен лишь для определе-ния общих и активных Т-лимфоцитов.

Для определения субпопуляций Т-лимфоцитов используют мо-ноклональные антитела или теофиллиновый тест. Методика количе-ственного определения Т-супрессоров и Т-хелперов мало отличается от описанного выше теста розеткообразования, за исключением добавле-ния в инкубационную среду раствора теофиллина. Клеточные мембраны Т-супрессоров, имеют рецепторы к теофиллину, который при взаимо-действии с клеткой ингибирует реакцию спонтанного розеткообразова-ния с эритроцитами барана. Т-хелперы таких рецепторов не содержат, поэтому при взаимодействии с эритроцитами барана даже при добавле-нии теофиллина образуются «розетки». С помощью моноклональных антител можно выявить все известные субпопуляции Т-, В- и О-лимфоцитов, в том числе так называемые естественные клетки-киллеры. Однако данный метод является очень дорогостоящим и в ветеринарной практике применяется редко.

Исходя из этого, нами была опробирована методика определения Т-хелперов и супрессоров с использованием феномена чувствительности данных клеток к температуре, применяемая в медицине.

Т-клетки, обладающие супрессорной активностью, чувствительные к температуре и не образуют Е-розетки при 290С, тогда как Т-хелперы термостабильны. Техника постановки аналогична определению общего числа Т-лимфоцитов. Производилась одновременная постановка розет-кообразования с эритроцитами барана при 40С и при 290С. А затем определяли разницу между количеством Е-РОК в различных темпера-турных режимах.

Для постановки реакции использовали кровь от серопозитивных и серонегативных свиней, различного возраста, полученную в течение не более 10-12 часов. Отбор крови у барана проводили из яремной вены, двумя разными способами. В первом случае, кровь отбирали в пробир-ку с антикоагулянтом (гепарин), с последующим хранением в стакане с водой при 40С. Во втором случае, цельную кровь дефибринировали в колбе со стеклянными бусами в течение 15-20 мин, аккуратно перелива-ли в центрифужные стаканчики и центрифугировали. Надосадочную жидкость сливали и проводили процедуру отмывания осадка эритроци-тов. Осадок эритроцитов после последнего центрифугирования прини-мают за 100%-ный, полученные эритроциты хранили в течение 2 недель при температуре 40С в растворе Олсвера. В дальнейшем, готовили 1% суспензию эритроцитов барана для постановки реакции. Для правиль-ной постановки реакции суспензию эритроцитов необходимо проверять в камере Горяева на отсутствие конгломератов и концентрацию ЭБ (50-100 эритроцитов в 1 квадрате).

Для получении суспензии лейкоцитов, использовали кровь, взятую путем венопункции с гепарином, из расчета 20 ЕД гепарина на 1 мл крови. После отстаивания, отсасывали слой плазмы с лейкоцитами, пе-реносили в сухую чистую пробирку и центрифугировали. После лизиса эритроцитов и получения суспензии лейкоцитов проверяли ее в камере Горяева на их жизнеспособность. К капле суспензии клеток добавляют 1-2 капли краски 0,1% раствора трипанового синего с эозином, смеши-вают и подсчитывали не менее 100 клеток, определяя процент окрашен-ных (мертвых). В суспензиях лейкоцитов их обычно бывает не более 1-3%.

После инкубации смеси в термостате и удаления надосадочной жидкости осадок осторожно ресуспензируют, без вспенивания, оставля-ют на 1 мин при комнатной температуре, а затем, делают мазки на обез-жиренных предметных стеклах. Мазки высушивают, фиксируют   мета-нолом  10 минут, окрашивают азур-эозином по Романовскому (РН 6.8) 1-2 мин. Подсчитывают под иммерсионным увеличением количество ро-зеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов, считая за розетку лимфо-цит, прикрепивший 3 и более эритроцитов.

В ходе постановки реакции для приготовления суспензии лейкоци-тов необходимо использовать 0,85% раствор натрия хлорида, для вы-равнивая осмотическое давление 1,7%-ным раствор натрия хлорида. Для центрифугирования использовали пластмассовые и стеклянные цен-трифужные пробирки. При использовании суспензии эритроцитов, по-лученной разными способами, существенной разницы в результатах не выявлено. Выход эритроцитарной массы выше оказался при использо-вании стеклянной посуды. После смешивания суспензии лейкоцитов и эритроцитов, общие Т-лимфоциты образовывали розетки при инкуба-ции в течение 1-2 часов, хотя лучше инкубировать 12-15 часов, при тем-пературе 40С.

При учете результатов реакции установлено, что в целом, у серо-позитивных животных наблюдалось увеличение количества Т-супрессоров, и снижение количества Т-хелперов, соответственно нару-шалось их соотношение. Это свидетельствует о наличии иммунодефици-та, вызванного герпесвирусом, в процессе его персистенции.

Выводы. Данную методику постановки реакции розеткообразова-ния можно использовать в ветеринарной практике, для оценки иммунно-го статуса у свиней, при подозрении на заболевания вирусной этиоло-гии, в том числе при герпесвирусной инфекции свиней.

Учитывая широкую степень распространения многих возбудите-лей среди людей и животных, биологическое сходство организма свиней и человека, способность вирусов и бактерий к мутации и адаптации, ди-агностика инфекции должна включать как методы выявления возбудите-лей и ретроспективную диагностику, так и методы регистрации иммун-ного ответа на внедрение инфекционного агента.

Литература. 1. Карпуть, И.М. Иммунология и иммунопатология болезней молодняка/И.М. Карпуть. – Мн.: Ураджай, 1993. – 288с. 2. Конотоп, Д.С. Герпесвирусные инфекции свиней и человека/Д.С. Коно-топ, В.Ф. Багрецов//Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию ветеринарии Курской области «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». – Курск, 2008. – С. 33-36. 3. Кузьмич, Р.Г. Герпесвирусная инфекция у сельскохозяйствен-ных животных/Р.Г. Кузьмич, В.В. Максимович, В.Ф. Багрецов, Д.С. Ко-нотоп//Эпизоотология, Иммунология, Фармакология, Санитария. – 2007 - №2. – С.15-19. 4. Новиков, Д.К. Клеточные методы иммунодиагности-ки/Д.К. Новиков, В.И. Новикова. – Мн.: Беларусь, 1979. – 222с.

DEFINITION OF SUBPOPULATIONS Т - LYMPHOCYTES AT PIGS WITH HERPESVIRUS INFECTION

Kuzmich R.G., Bagretsov V.F., Кonotop D.S.

Vitebsk State Academy of Veterinary Medicine

Vitebsk, Republic of Belarus

For diagnostics of virus infections it is neсessary to use methods of di-agnostics immune status, especially functional condition of various subpop-ulations Т-cells, in addition to the basic methods of diagnostics.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021