ГЕЛЬМИНТООВОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ГЕЛЬМИНТОЗОВ

Гельминтоовоскопия — это группа методов исследований, основанных на разнице удельной массы яиц гельминтов и жидкой среды. При использовании гельминтоовоскопии применяют флотационные или седиментационные способы, или их комбинации.

В процессе гельминтоовоскопии важным является соблюдение определенных стандартов. Считается, что на результаты исследования (независимо от его метода) влияют: величина массы пробы фекалий, время флотации или седиментации, размер ячеек фильтрационной сетки, диаметр кольца петли, форма, высота и объем стаканчиков и другие факторы (Г. А. Котельников, В. М. Хренов, 1984).

В связи с этим во Всероссийском институте гельминтологии им. академика К.И. Скрябина отработаны параметры, соблюдение которых позволяет получить наиболее объективные результаты. Вот перечень некоторых из них.

1. Масса пробы фекалий при применении методов флотации, седиментации или их комбинаций должна составлять 3 г.

2. Соотношение массы фекалий к раствору должно быть 3 :50.

3. Лучшие результаты исследований получают при применении раствора аммиачной селитры (плотность 1,3) через 10—15 мин от начала флотации.

4. Более точные результаты исследований при флотации получают с использованием стеклянных мензурок объемом 50 мл, с применением проволочной петли для снятия яиц с поверхности раствора с диаметром кольца 8—10 мм при исследовании не менее 3 капель поверхности взвеси пробы.

Методы флотации

Метод Ф. Фюллеборна — один из наиболее распространенных методов диагностики гельминтозов. Он заключается в том, что в стакане емкостью 200 мл размешивают 8—10 г свежих фекалий животных с 20-кратным объемом насыщенного раствора хлорида натрия. После тщательного размешивания взвесь фильтруют через металлическое или капроновое ситечко (можно через марлю) в другой чистый стакан емкостью 100 мл и оставляют на 45—60 мин. Затем проволочной петлей с поверхности взвеси стакана берут 3—6 капель н наносят на хорошо обезжиренное предметное стекло, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. После каждого исследования стаканы, стекла и стеклянные палочки моют, стекла обезжиривают, а металлические петли обжигают на пламени спиртовки или газовой горелки, что предупреждает перенос яиц паразитов из одной пробы в другую.

В связи с тем, что плотность насыщенного раствора поваренной соли составляет 1,18—1,20, этим методом выделяется только часть яиц нематод, так как плотность яиц трихоцефал составляет 1,16—1,22, неоплодотворенных яиц аскарид—1,26.

Метод флотации с аммиачной селитрой по Г. А. Котельникову и В. М. Хренову — один из наиболее эффективных методов диагностики аскаридатозов, трихоцефалезов, стронгилятозов, мониезиозов, стронгилоидозов, эймериозов и других паразитозов сельскохозяйственных и домашних животных.

Суть метода состоит в том, что пробу фекалий массой 3 г кладут в стаканчик, добавляют раствор аммиачной селитры плотностью 1,3 и тщательно размешивают стеклянной палочкой. Затем раствор соли порциями доливают до 50 мл. Полученную взвесь фильтруют через металлическое или капроновое ситечко в другой стаканчик и дают отстояться в течение 10 мин. При диагностике стронгилятозов достаточно, чтобы взвесь отстоялась в течение 3—5 мин. После этого металлической петлей с поверхности взвеси снимают 3—6 капель с разных мест и переносят их на предметное стекло. Исследование проводят при малом увеличении микроскопа сразу же после нанесения капель на предметное стекло, так как со временем в каплях образуются кристаллы аммиачной селитры, что затрудняет просмотр препарата.

Метод флотации с аммиачной селитрой и с центрифугированием нашел широкое применение в научной и практической работе ветеринарных специалистов Беларуси. Он отличается высокой эффективностью при диагностике ряда цестодозов, аскаридатозов, стронгилятозов, эймериозов и других паразитозов животных.

Пробу фекалий массой 3 г в стаканчике размешивают с 50 мл раствора аммиачной селитры плотностью 1,3. Полученную взвесь фильтруют через металлическое или капроновое ситечко с диаметром ячеек 0,5х0,5 мм в пробирку и центрифугируют 2 мин со скоростью 1500 об/мин. Затем металлической петлей с поверхности взвеси в пробирке снимают 3—6 капель и микроскопируют.

Поверхностный слой в центрифужной пробирке можно снять и таким способом. Если пробирка заполнена взвесью до краев, ее покрывают покровным стеклом, чтобы поверхность взвеси в пробирке прикоснулась к предметному стеклу. Через несколько минут предметное стекло снимают и микроскопируют.

Метод флотации с применением натриевой селитры считается высокоэффективным при применении раствора с плотностью 1,38—1,40 для диагностики аскаридатозов, стронгилятозов, трихоцефалезов, стронгилоидозов, эймериозов и других паразитозов.

Технически исследования проводятся так же, как и методом флотации с применением аммиачной селитры. Капли с поверхности стаканчика или центрифужной пробирки можно снимать через 8—10 мин для проведения исследований.

Метод Дарлинга состоит в том, что берут пробу свежих фекалий массой 5 г, смешивают в стакане с водой в соотношении 1 : 10, через ситечко процеживают в пробирку, центрифугируют 2 мин при скорости 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют в равных частях глицерин и насыщенный раствор хлористого натрия. Чистой стеклянной палочкой взвесь тщательно размешивают и повторно центрифугируют. При наличии в пробе фекалий яиц гельминтов они всплывают на поверхность жидкости в центрифужной пробирке. Проволочной петлей берут 3—6 капель с поверхности взвеси, наносят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод И. А. Щербовича предполагает в качестве флотационного раствора применять насыщенный раствор сульфата магния. Пробу фекалий из 3—5 г помещают в стаканчик и размешивают в воде в соотношении 1:10, отстаивают 5 мин, сливают, оставляя 10 мл осадка. Взвесь фильтруют в пробирку, центрифугируют в течение 2 минут со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют насыщенный раствор сульфата магния и повторно центрифугируют. После этого с поверхностного слоя жидкости в пробирке проволочной петлей снимают 3—6 капель, помещают на предметное стекло и микроскопируют. Диагностируют аскаридатозы, стронгилятозы, эймериозы и другие паразитозы.

Метод флотации с использованием гипосульфита натрия с плотностью 1,4 в обычном исполнении (как и с аммиачной селитрой) применяется для диагностики ряда нематодозов жвачных и свиней, эймериозов. Время флотации 10 мин.

Метод В. Н. Трача предназначен для количественного подсчета яиц гельминтов. Для этого пробу фекалий (крупного рогатого скота и свиней — 5 г, мелких жвачных — 2,5 г) помещают в стаканчик диаметром 5 см и емкостью 100 мл. Периодически помешивая, в стаканчик наливают раствор аммиачной селитры плотностью 1,3. Взвесь отстаивают и через 45 мин с ее поверхности металлической петлей диаметром 5 мм берут (с центра и периферии стаканчика) 5 капель, переносят на предметное стекло и микроскопируют. Подсчитывают все яйца гельминтов в 5 каплях взвеси. Затем определяют количество яиц паразитов в одной капле. Для определения количества яиц в пробе площадь поверхности стаканчика делят на площадь петли и умножают на количество яиц в одной капле. Полученное число делят на массу фекалий в пробе и определяют количество яиц паразитов в 1 г фекалий.

Методы седиментации

Эти методы основаны на принципе осаждения взвешенных яиц гельминтов, промывания осадка и его исследования.

Метод последовательных промываний состоит в том, что 3 г свежих фекалий кладут в стаканчик (100 мл) и тщательно размешивают с водой, доводя объем до 50 мл. Полученную смесь фильтруют через металлическое или капроновое ситечко, отстаивают в течение 10 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают, оставляя в стакане 3—5 мл осадка и к нему добавляют опять 50— 70 мл воды, снова отстаивают и сливают надосадочную жидкость. Так повторяют несколько раз, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Затем ее сливают, осадок выливают на предметное стекло (или чашку Петри) и микроскопируют.

Этим методом можно диагностировать фасциолез, парамфистоматидозы, дикроцелиоз и другие гельминтозы.

Флотационно-седиментационный метод Н. В. Демидова применяют для диагностики фасциолеза. Для этого от крупного рогатого скота берут пробу фекалий массой 5 г (от овец - 3 г), помещают ее в стакан емкостью 200 мл, при постоянном помешивании доливают 200 мл насыщенного раствора хлористого натрия и отстаивают 20 мин. Металлической сеточкой удаляют с поверхности взвеси крупные частицы. Надосадочную жидкость сливают или отсасывают спринцовкой, оставляя на дне 25-30 мл ее. Затем оставшийся осадок размешивают стеклянной палочкой, фильтруют в чистый стакан через металлическое сито или марлю и отстаивают 5 мин. После этого надосадочную жидкость отсасывают спринцовкой, оставшиеся 15-20 мл осадка переливают в конические стаканы, отстаивают 5 минут, надосадочную жидкость сливают и осадок опять промывают. Так повторяют несколько раз, потом осадок помещают на предметное стекло и микроскопируют.

Метод седиментации с целлофановыми пленками по Г. А. Котельникову и В. М. Хренову. Вначале заготовляют целлофановые пленки. Для этого из гидрофильного целлофана толщиной 22 мкм нарезают прямоугольные кусочки размером 2х3 см и помещают их на 24 ч в чашку Петри, содержащую 50%-ный раствор молочной кислоты (можно глицерина). На 500 целлофановых пленок необходимо иметь 100 мл раствора молочной кислоты.

После подготовки целлофановых пленок берут пробу фекалий массой 2 г и размешивают их в стаканчике с небольшим количеством воды. Взвесь фильтруют через металлическое ситечко в другой чистый стакан емкостью 50 мл, отстаивают в течение 5 мин, сливают надосадочную жидкость, а к осадку добавляют 35-40 мл водопроводной воды, опять отстаивают 5 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок переносят на предметное стекло и покрывают целлофановой пленкой. Через 810 минут проводят микроскопирование препарата. Метод применяется для диагностики фасциолеза, парамфистоматидозов, аскаридатозов, трихоцефалезов и других паразитозов животных.

Метод А. Ю. Вишняускаса применяется для диагностики фасциолеза, парамфистоматидозов, трихоцефалезов, мониезиоза и стронгилятозов желудочно-кишечного тракта.

Суть метода состоит в том, что берут 3 г фекалий крупного рогатого скота (или 1 г фекалий мелких жвачных), помещают в ступку, добавляют 45-50 мл воды и размешивают. Полученную взвесь фильтруют через металлическое или капроновое сито в мерный стакан или мензурку емкостью 100 мл. Ступку и сито прополаскивают водой и доводят объем взвеси до 100 мл, отстаивают 5 мин. Затем верхний слой осторожно сливают (или отсасывают с помощью груши) с таким расчетом, чтобы на дне стакана осталось 20 мл взвеси с осадком. Осадок аналогичным образом еще раз промывают водой, отстаивают и надосадочную жидкость сливают, оставляя в стакане 10 мл осадка с жидкостью. Для дальнейшего исследования необходимо иметь центрифужные пробирки (10 мл) с шлифованными краями. В такую пробирку наливают оставшиеся в стакане 10 мл жидкости с осадком и центрифугируют 1-2 минуты со скоростью 1500 об/мин. Затем верхний слой жидкости сливают, а к осадку добавляют раствор сульфата цинка (ZnSO4 -7H2O) с плотностью 1,24. Мениск жидкости должен быть выше краев центрифужной пробирки. После этого центрифужную пробирку покрывают покровным стеклом таким образом, чтобы жидкость полностью с ним соприкасалась. Затем центрифугируют в течение 0,5-1 минут со скоростью 1500 об/мин. Всплывшие при этом яйца гельминтов прилипают к покровному стеклу, которое снимают с пробирки, помещают на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Я. Д. Никольского состоит в том, что в стаканчик емкостью 100 мл наливают 20 мл водопроводной воды и помещают туда 8—10 г фекалий овец. Если в стаканчиках свежие фекалии, их встряхивают через 5 мин, если подсохшие - через 15 минут. Вслед за этим жидкость из стаканчиков сливают в серологические пробирки, отстаивают ее в течение 2 часов, а фекалии выбрасывают. Затем жидкость из пробирок отсасывают грушей с длинным наконечником, а осадок наносят на стекло и микроскопируют. Этот метод применяют для диагностики мониезиоза овец.

Метод С. Ф. Пауликони применяют для диагностики фасциолеза. В принципе это метод последовательных промываний, при котором 5 г фекалий крупного рогатого скота помещают в конусовидной формы цилиндр объемом 250 мл и диаметром в нижней части 3 см. К пробе фекалий при постоянном помешивании добавляют 200 мл водопроводной воды и отстаивают 5 минут. Промывание повторяют еще три раза, причем второй, третий и четвертый периоды отстаивания взвеси длятся соответственно 5, 4 и 3 мин. Жидкость из цилиндра отсасывают спринцовкой, оставляя на дне 0,5 см осадка, который после промывания помещают на предметное стекло (желательно градуированное на квадраты) и подсчитывают количество яиц фасциол для определения интенсивности инвазии. При этом используют формулу:

60

где а - количество осадка, мл; б — количество обнаруженных яиц фасциол, шт.; в—количество взятых для исследования фекалий, мл; г — количество исследованного осадка, мл; х—число яиц фасциол в 1 мл фекалий.

Комбинированный метод с раствором аммиачной селитры по Г. А. Котельникову и В. М. Хренову состоит в том, что берут пробу фекалий массой 3 г, помещают в стаканчики емкостью 50 мл и хорошо размешивают с водой. Полученную взвесь фильтруют в стаканчик, отстаивают, сливают, а осадок в количестве 10 мл помещают в пробирки и центрифугируют 2 минуты со скоростью 1500 об/мин. После удаления надосадочной жидкости к осадку добавляют раствор аммиачной селитры, размешивают стеклянной палочкой (после каждой пробы ее надо тщательно промывать) и повторно центрифугируют в течение 2 мин при указанной скорости. После этого с поверхности жидкости пробирки металлической петлей снимают 3-6 капель взвеси, помещают их на обезжиренное предметное стекло и микроскопируют. Оставлять предметное стекло с каплями взвеси на какое-либо время не следует, так как аммиачная селитра быстро образует кристаллы, что мешает просматривать препарат.

Этот метод эффективен для диагностики аскаридатозов, трихоцефалезов, метастронгилеза, стронгилоидозов, стронгилятозов желудочно-кишечного тракта, тениидозов и эймериозов.

Овоскопия нативных препаратов по К. Като. Перед проведением диагностических исследований готовят целлофановые полоски размером 8,2 см. Их готовят из гидрофильного целлофана путем погружения в специальную смесь следующего состава: к 500 мл 6%-ного раствора карболовой кислоты добавляют 6 мл 3%-ного водного раствора малахитовой зелени и 500 мл глицерина. На 1000 целлофановых пленок расходуется 200 мл указанной смеси. Срок подготовки полосок составляет 24 ч.

Суть метода К. Като состоит в том, что на обезжиренное предметное стекло наносят 0,1 г свежих фекалий, покрывают целлофановой полоской и придавливают. Препарат микроскопируют в течение часа после приготовления, а в теплое время года через 30—40 минут. Методику К. Като можно применять для диагностики аскаридиоза, гетеракидоза и капилляриоза птиц. Эффективность ее при гельминтозах свиней ниже, чем метода флотации. Для диагностики гельминтозов жвачных ее применять нецелесообразно (Г. А. Котельников, В. М. Хренов, 1984).

Метод Столла. Он заключается в том, что в градуированный цилиндр наливают 0,56 мл раствора едкого натрия, который готовят путем добавления к 1 л воды 4 г щелочи. Затем в цилиндр вносят 4 см свежих фекалий и 10 стеклянных дробинок диаметром 3 мм. Цилиндр закрывают пробкой, взбалтывают в течение 2 мин, а затем сразу же отбирают 0,15 мл взвеси (в которой содержится 0,01 см3 фекалий) и помещают на предметное стекло в виде двух капель. Их покрывают стеклами и подсчитывают под микроскопом количество яиц в обеих каплях и умножают на 100. Полученное число определяет количество яиц гельминтов в 1 см фекалий.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021