Методы постановки реакции гемагглютинации и торможения гемагглютинации (на примере обнаружения коронавирусных антигенов и выявления противокоронавирусных антител)

Реакция гемагглютинации основана на принципе агглютинации эритроцитов различных видов животных вирусами, обладающими гемагглютинирующими свойствами.

При диагностике пневмоэнтеритов телят реакция гемагглютинации применяется для обнаружения вирусов, обладающих гемагглютинирующими свойствами, - вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, адено-, рота- и коронавирусов.

Компоненты реакций:

Р а с т в о р А л ь с е в е р а, используется для консервирования крови и состоящий из: глюкоза 24,6 г, натрий лимоннокислый 9,6 г, натрий хлористый 5,10 г, вода дистиллированная до 1200 мл. Его стерилизуют в водяной бане по 35 минут в течение трех дней.

Ф о с ф а т н о - б у ф е р н ы й и з о т о н и ч е с к и й р а с т в о р: раствор А = N а 2 НРО 4 х 2Н2 О - 53,72 г на 1 л дист.  воды раствор Б= КН2 РО4 - 20,42 г на 1 л дист. воды раствор В= NаС1 - 8,5 г на 1 л дист. воды

Для приготовления ФБР с рН 7,2 смешивают 430 мл раствора А, 119 мл раствора Б и 500 мл раствора В.

С у с п е н з и я э р и т р о ц и т о в м ы ш е й и л и к р ы с. Кровь берут путем тотального обескровливания животного в раствор Альсевера, центрифугирют в течение 10 минут при 2000 об/мин. Осадок эритроцитов трижды отмывают в ФБР и из отмытых эритроцитов готовят на ФБР 0,5% -ную суспезию.

К о р о н а в и р у с н ы й а н т и г е н, полученный из культурной вируссодержащей жидкости, обладающий гемагглютинирующими свойствами.

С п е ц и ф и ч е с к а я а н т и к о р о н а в и р у с н а я с ы в о р о т - к а, содержащая антитела к коронавирусу, получена путем гипериммунизации телят.

И с п ы т у е м ы е а н т и г е н ы — 25—50%-ная суспензия фекалий или кусочки кишечника, измельченные ножницами и растертые в ступке с песком.

Такую суспензию осветляют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин, вносят пенициллин и стрептомицин из расчета 2000 ед/мл и в дальнейшем используют для постановки РГА и РТГА.

И с с л е д у е м ы е с ы в о р о т к и к р о в и. С целью освобождения их от ингибиторов, проводят инактивацию при 60°С в течение 30 мин, затем обрабатывают каолином, для чего к 0,5 мл сыворотки добавляют 0,25 мл 25%-ного каолина, выдерживают 30 мин при 37°С и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. В дальнейшем сыворотку обрабатывают эритроцитами мышей (крыс). Для этого в обработанную каолином сыворотку добавляют 0,25 мл 10%-ной суспензии эритроцитов и после часовой экспозиции при комнатной температуре освобождаются от эритроцитов путем центрифугирования при 1500—2000 об/мин в течение 15 мин. Стартовое разведение сыворотки 1:2.

Техника постановки РГА. С целью выявления коронавирусного антигена в пробах фекалий и кишечника проводят постановку реакции гемагглютинации микрометодом.

Используя микроплашки, в каждую лунку вносят по одной капле (0,025 мл) ФБР. Затем в каждую первую лунку вносят по одной капле исследуемого вируссодержащего материала и готовят последовательные двойные разведения. Для этого после 3 -кратного пипетирования из первой лунки одну каплю переносят во вторую лунку и т.д. Из последней одну каплю удаляют в дезраствор. В дальнейшем во все лунки вносят по одной капле 0,5%-ной суспензии эритроцитов. При этом обязательным является контроль на возможность спонтанной агглютинации.

Плашки осторожно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 60 мин. Учет результатов реакции производят через час после добавления суспензии эритроцитов, а затем оставляют при 4°С на 16—18 часов и повторно просматривают плашки. За агглютинирующий титр вируса принимают наибольшее его разведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов не менее чем на 2+.

Диагностическим показателем РГА считают разведение 1:8 и более для подтверждения специфичности РГА и доказательства принадлежности гемагглютининов коронавирусу проводят постановку РТГА со специфической сывороткой.

Техника постановки РТГА. Проведение РТГА включает следующие этапы:

-определение рабочей дозы вирусного диагностикума; постановка основного опыта.

На первом этапе титруется вирусный диагностикум в РГА по методике, описанной выше. Определяется одна гемагглютинирующая единица (1 ГАЕ), составляющая то наибольшее разведение, при котором четко выражена агглютинация эритроцитов не менее чем на 2+. Для основного опыта используется 4 ГАЕ. Для этого показатель титра в 1 ГАЕ делят на 4. Так, если

1 ГАЕ составила титр 1:256, то рабочее разведение для РТГА будет равно 1:64. Достоверность расчетов и подбора рабочей дозы вируса (4 ГАЕ) определяют постановкой РГА.

В процессе проведения основного опыта РТГА, используя ФБР готовят последовательные двойные разведения исследуемых проб сыворотки крови, которые ранее были освобождены от ингибиторов и изогемагглютининов. Для этого в каждую лунку микроплашки вносят по 1 капле ФБР, а затем в каждую первую лунку — по 1 капле исследуемой сыворотки крови. После 3-кратного пипетирования из первой лунки 1 каплю переносят во вторую и т.д. Из последней лунки 1 каплю удаляют в дезраствор. В дальнейшем во все лунки вносят по 1 капле вирусного диагностикума, содержащего 4 ГАЕ.

Плашки осторожно, но тщательно встряхивают и после часового контакта сыворотки с атигеном в каждую лунку добавляют по 2 капли 0,5%-ной взвеси эритроцитов, снова осторожно встряхивают плашки и оставляют их при комнатной температуре в течение часа, а если необходимо, дополнительно выдерживают при 4°С в течение 16—18 часов. Основанием для проведения учета результатов реакции считается полное оседание эритроцитов в контролях: контроль рабочей дозы вируса (4 ГАЕ); контроль эритроцитов на самоагглютинацию; контроль испытуемой сыворотки; контроль 4 ГАЕ с нормальной сывороткой; контроль 4 ГАЕ со специфической сывороткой.

Диагностическим титром, когда сыворотка считается положительной является разведение ее 1:32 и выше, где установлено торможение агглютинации эритроцитов не менее чем 2+.

Анализируя эффективность при использовании РГА и РТГА в диагностике коронавирусного энтерита, уместно напомнить о том, что указанные тесты могут быть с успехом применены и для диагностики ротавирусной инфекции по описанным выше методикам, но при использовании эритроцитов морской свинки или нулевой группы человека.

При экспресс-изучении эпизоотической ситуации по отдельному хозяйству следует провести исследование проб сыворотки крови больных (не мене 10% животных) и клинически здоровых новорожденных телят, подобранных по принципу аналогов. В этом случае принимают во внимание тот факт, что телята должны быть получены от неиммунных коров, при наличии характерных симптомов болезни и разности в титрах антител не менее чем в 3—4 раза между указанными группами животных, можно решить вопрос по диагностике болезни.

Ретроспективная диагностика предусматривает выявление прироста титра специфических антител в парных пробах сыворотки крови с помощью РТГА, РН, ИФА.

Диагноз считают установленным в одном из следующих случаев: -при выявлении вируса, выделенного из исходного материала в культуре клеток, вызывающего специфический ЦПЭ с последующей идентификацией в РН, РТГА и ИФА;

-при индикации вирионов с характерной морфологией в исследуемом материале методом иммуноэлектронной микроскопии;

-при обнаружении коронавирусных антигенов в пробах фекалий или соскобов со слизистой оболочки в РИФ, ИФА и РИД при наличии характерных клинических и патологоанатомических показателей, с учетом эпизоотической обстановки;

-при 3—4 кратном увеличении титра антител во второй пробе сыворотки крови в сравнении с первой при ретроспективной диагностике.

В процессе проведения дифференциальной диагностики необходимо исключить ротавирусную и аденовирусную инфекции, сальмонеллез, стрептококкоз, анаэробную энтеротоксемию, криптоспоридиоз, а также незаразные болезни, сопровождающиеся поражением желудочно-кишечного тракта.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021