33. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЙОДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Принцип метода. Метод основан на катализирующем действии йодид-иона на ре-акцию окисления роданид-иона железом, при этом происходит обесцвечивание раствора. Чувствительность реакции 10–5 мкг/мл.

Реактивы.

1. 10%-ный раствор сернокислого цинка (ZnSО4.7Н2О). 100 г соли растворяют в 900 мл бидистиллированной воды.

2. 0,5 Н раствор едкого натра. 20 г NaOH растворяют в 1 л воды.

3. 3% раствор углекислого калия (К2СО3). 30 г соли растворяют в 970 мл воды.

4. 30% раствор углекислого калия (К2СО3). 300 г соли растворяют в 700 мл воды.

5. 2 Н раствор едкого кали (КОН). 112 г щёлочи растворяют водой в мерной колбе на 1 л.

6. 0,006 М раствор роданида калия (KCNS). 0,6 г вещества растворяют водой в мерной колбе на 1 л.

7. 0,235 М раствор нитрита натрия (NaNO2). 20 г вещества растворяют водой в мерной колбе на 1 л.

8. 5%-ный раствор азотнокислого калия (КNO3). 50 г соли растворяют в 950 мл во-ды.

9. 0,255 М раствор железоаммонийных квасцов (NH4Fe(SO4)2.12 Н2О в 2 н точно оттитрованном растворе азотной кислоты. 100 г квасцов нагревают в 1 л 2 н кислоты, выдерживают 10-12 часов и фильтруют.

10. Стандартный раствор йода. Основной раствор должен содержать 500 мкг в 1 мл. Калия йодид (KI) высушивают при 105°С до постоянного веса и растворяют 0,131 г соли в мерной колбе на 200 мл водой. Хранят в холодильнике. Срок годности реактивов, используемых при колориметрировании (п.п.6-10) не должен превышать шести месяцев.

Оборудование и аппаратура.

1. Фотоэлектроколориметр.

2. Сушильный шкаф

3. Термостат.

4. Центрифуга на 3000 об/мин.

5. Муфельная печь.

6. Секундомер.

7. Пробирки центрифужные.

8. Пробирки с притертой пробкой на 8-10 мл

9. Штативы для пробирок.

10. Стаканчики кварцевые на 20-50 мл (можно платиновые или, в крайнем случае, новые с неповрежденной глазурью фарфоровые чашки № 1).

11. Пипетки автоматические и обычные.

Материал для исследования.

Материалом для исследования могут служить любые биологические объекты, в т.ч. сыворотка крови, молоко, вода, корма и др.

Ход определения.

Исследование сыворотки крови.

В сыворотке крови определяют три формы йода - связанный с белками (СБЙ), не-органический и общий йод. Для оценки функционального состояния щитовидной железы выводят йодный коэффициент.

Определение связанного с белками йода (СБЙ).

1. В центрифужную пробирку вносят 1 мл сыворотки крови, 3 мл свежей биди-стиллированной воды, 0,5 мл 10%-ного раствора сернокислого цинка и 0,5 мл 0,5 н рас-твора едкого натра. Тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Выдерживают 30 минут при комнатной температуре. Параллельно ставится холодный опыт (контроль), со всеми реактивами, кроме сыворотки крови.

2. Центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин. Супернатант используют для опре-деления неорганического йода (хранить можно в течение суток) или сливают. Пробирку с осадком переворачивают на фильтровальную бумагу.

3. К осадку добавляют 1 мл 2 н раствора едкого калия, перемешивают стеклянной палочкой, которую затем смывают 1 мл воды. Пробу переносят в кварцевый стаканчик и 1 мл воды обмывают палочку и пробирку.

4. Осадок высушивают в сушильном шкафу при 105 °С в течение 10-12 часов, а за-тем помещают в холодную муфельную печь, доводят температуру при закрытой дверце до 600 °С, периодически (3-4раза) открывая дверцу на 15 сек. для ускорения процесса озоле-ния. Если озоление произошло не полностью, в пробах имеются частички тёмного цвета, то пробирки (стаканчики) охлаждают, осадок смачивают 2-3 каплями 5%-ного раствора азотнокислого калия, высушивают при температуре 150 °С 30 минут, переносят в разо-гретый (150-200°С) муфельную печь, доводят температуру до 600°С и выдерживают 15 минут.

5. Пробы охлаждают, золу с помощью стеклянной палочки смывают со стенок чашки в центрифужную пробирку пятикратным добавлением воды (по 1 мл.). Тщательно перемешивают.

6. Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант должен быть прозрачным. Далее готовят стандартные растворы.

7. Рабочий раствор готовят перед опытом: раствор А (концентрация йода 10 мкг/мл) - берут 1 мл основного раствора йода и доводят водой до 50 мл; раствор Б (содер-жание йода 40 нг/мл) - берут 1 мл раствора А и доводят водой до 250 мл.

Стандартные растворы готовят из раствора Б по следующей схеме:

№ пробирок

Поочередно вносят, мл

Концентрация йода, нг/мл

раствор Б

вода

          1. (контроль)

          2.

          3.

          4.

                       0                        4,0

0,5                             3,5

1,0                             3,0

1,5                             2,5

0

20

40

60

Приливают по 0,4 мл 0,006 М раствора роданида калия, затемняют комнату и вно-сят те же реактивы, что и в пробы (п. 8).

8. В чистую пробирку с притёртой пробкой вносят 2 мл прозрачного центрифуга-та. 2 мл бидистиллированной воды и 0,4 мл 0,006 М раствора роданида калия. Затемняют комнату и начиная со стандартов, вносят в каждую пробирку по 1 мл 0,235 М раствора нитрита натрия и 1,6 мл 0,2 М раствора железоаммонийных квасцов. Пробирку дважды взбалтывают и включают секундомер. С интервалом в 1 минуту заливают два последних реактива в последующие пробирки. Пробы накрывают тёмной бумагой.

9. Выдерживают 20 минут, если температура окружающего воздуха >26°С, 25 ми-нут при 22-23°С, 30 минут при 18°С ( ниже 18°С реакция не идёт).

Поскольку кинетика реакции сильно зависит от температуры воздуха и растворов, вначале проводят исследование стандартных растворов. Пробы следует предохранять от попадания прямых солнечных лучей, поскольку свет, как и йод, катализирует эту реак-цию.

10. Определяют оптическую плотность на ФЭКе при синем светофильтре (430 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мл против воды с интервалом в 1 минуту по секундомеру. По полученным данным строят калибровочный график, по которому определяют концен-трацию йода в пробах.

Расчет результатов.

Содержание йода в пробах определяется по формуле:

 21

где

а - количество йода в нанограммах (нг), найденное по графику, за вычетом йода в холостом опыте;

5 - объём раствора золы, мл;

100 - перевод в мкг %;

2 - объём центрифугата, взятого на определение, мл;

1 - объём сыворотки, мл;

1000 - мг в нг.

Определение неорганического йода.

Для определения используют прозрачный центрифугат, полученный после оса-ждения белков сыворотки крови. Отбирают по 4 мл центрифугата и проводят реакцию, начиная с п. 8.

Определение общего йода.

Общий йод определяют по сумме связанного с белками (СБЙ) и неорганического йода.

Определение йодного коэффициента.

Йодный коэффициент выводят из соотношения связанного с белками йода и неор-ганического йода.

Исследование молока.

Для анализа берут 1 мл молока, перемешивают с 1 мл 2,0 Н раствора едкого калия, высушивают при 15 °С и далее делают все операции, начиная с п.4.

Исследование воды.

5 мл воды перемешивают с 0,2 мл 3% раствора углекислого калия, высушивают и озоляют в течение 5 мнут после достижения температуры в муфеле 600°С. Далее всё по-вторяют, начиная с п. 5.

Стандартные растворы йода готовят из рабочего, содержащего 10 мкг/мл (А) по схеме:

пробирок

Поочередно вносят, мл

Концентрация йода, нг/мл

раствор А

вода

                     1 (контроль)                                      –                                          4,0                               0

                     2                                                       0,6                                         3,4                               6

                     3                                                       1,2                                         2,8                               12

                     4                                                       1,8                                         2,2                              18

Время реакции при температуре 20°С примерно 80 минут.

Исследование кормов.

Берут навеску воздушно-сухого, измельченного до однородной массы образца в количестве 0,2 г, добавляют 1,2 мг 3% раствора углекислого калия, перемешивают и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Высушивают при 150°С и да-лее все операции, начиная с п.4.

Стандартные растворы йода готовят из рабочего, содержащего 40 нг/мл (Б) по схеме:

№ пробирок

Поочередно вносят, мл

Концентрация йода,

нг/мл

раствор Б

вода

K2CO3

         1 (контроль)                                0                            3,5                             0,5                               0

         2                                                   0,6                         2,9                             0,5                              24

         3                                                   1,2                         2,3                              0,5                               48

         4                                                   1,8                         1,7                              0,5                              78

Примечания.

Анализы необходимо проводить в отдельной комнате, где не должно быть даже следов йода.

Посуда и пробирки должны быть химически чисто вымыты вначале щелочным де-тергентом (стиральный порошок, сода и др.), затем хромовой смесью и несколько раз промыты дистиллированной водой.

Для приготовления растворов и при анализе используют только свежеприготов-ленную бидистиллированную воду. Все реактивы - марки х.ч.

Определение оптической плотности проб желательно проводить сразу же после озоления, но не позже 8-10 часов.

ЗНАЧЕНИЕ. Основная доля йода в организме приходится на щитовидную железу, где он входит в состав гормонов тироксина и тирозина. От деятельности щитовидной же-лезы в значительной степени зависит уровень и интенсивность обмена белков, углеводов, жиров, минеральных веществ и витаминов.

Низкое соотношение связанного с белками йода к неорганическому йоду, близкое к 1, даже при низком уровне СБЙ свидетельствует о достаточном обеспечении организма гормонами щитовидной железы, в то время как высокий уровень СБЙ при недостатке йо-да (соотношение СБЙ к неорганическому йоду более 4) является показателем напряжен-ного функционального состояния щитовидной железы.

Снижение уровня йода отмечают при эндемическом зобе, связанном с дефицитом йода в кормах и воде, кетозе, остеодистрофии.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021