31. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЪНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМЫ КРОВИ

Принцип метода. Метод основан на регистрации скорости окисления восстанов-ленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ) кислородом, растворенным в реакционной среде. При этом бесцветная лейкоформа 2,6-ДХФИФ переходит в окрашен-ную форму, имеющую максимум поглощения при 600 нм.

Реактивы.

1.0,25 М фосфатный буфер, рН 7,4 (7,8 г NaH2PO4 ×2H2O растворяют в 100 мл ди-стиллированной воды - раствор №1; 11,4 г К2НРО4×3Н2О растворяют в 100 мл дистилли-рованной воды - раствор №2. К 81 мл раствора №2 приливают 19 мл раствора № 1 и из-меряют рН на рН-метре. Доводят объем до 200 мл дистиллированной водой).

2. 0,8 мМ водный раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола в окисленной форме (11,6 мг 2,6-ДХФИФ растворяют в 50 мл дистиллированной воды). Раствор готовится за сутки до проведения анализов.

3. 3,2 мМ раствор закисного сернокислого железа (44,5 мг FeSO4×7Н2О растворяют в 50 мл дистиллированной воды). Раствор готовится непосредственно перед проведением анализов.

Оборудование и аппаратура.

1.Спектрофотометр любой марки с термостатируемой кюветой или спектроколо-риметр "Спекол – 20 или 210, 211, 220, 221" с термостатируемой кюветой.

2.  Ультратермостат.

3.  Водяная баня.

4.  Весы аналитические.

5.  Колбы мерные.

6.  Пипетки измерительные.

7.  Микропипетки или микрошприц на 10 и 20 мкл

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит плазма крови.

Ход определения.

1.  В термостатируемую кювету (37 С) последовательно добавляют 0,5 мл фосфат-ного буфера рН 7,4, 0,15 мл раствора 2,6-ДХФИФ, 0,15 мл раствора закисного сернокис-лого железа и быстро перемешивают. Все растворы должны иметь температуру 37°С.

2. Сразу после перемешивания быстро добавляют 10 или 20 мкл плазмы крови, пе-ремешивают и через каждые 30 сек (по секундомеру) после добавления плазмы на протя-жении 5  мин  измеряют оптическую плотность при 600 нм против воды (D5OП).

3. Определяют скорость окисления 2,6-ДХФИФ в реакционной среде по п. 1 и 2, но вместо плазмы крови добавляют такой же объем дистиллированной воды D5К).

4. Определяют оптическую плотность при 600 нм инкубационной среды, в кото-рой 2,6-ДХФИФ окислен полностью. Для этого в кювету добавляют те же компоненты, но вместо раствора FeSO4 и пробы, добавляют равные им объемы дистиллированной во-ды (DМАКС).

Расчет результатов.

Определяют значение констант скоростей окисления 2,6-ДХФИФ в контроле и опыте по формулам:

24

Рассчитывают константу ингибирования (Ки) плазмой крови окисления 2,6-ди-хлорфенолиндофенола, являющуюся показателем ее антиокислительной активности по формуле:

 23

где

Ки - антиокислительная активность плазмы крови, л х мл–1×мин–1

Кк - константа скорости окисления 2,6-ДХФИФ в контроле

Коп - константа скорости окисления 2,6-ДХФИФ в опыте

С - концентрация плазмы в инкубационной смеси, мл/л

Примечания.

1. Плазма крови должна быть без следов гемолиза.

2. Исследование должно проводится не позднее 6 часов после взятия крови.

 

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021