28. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ В КРОВИ

Принцип метода. Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина перекисью водорода при участии фермента с образованием окрашенного про-дукта реакции, имеющего максимум поглощения при 520 нм.

Реактивы.

1. 2,5 мМ раствор бензидина (184,2 мг бензидина растворяют при нагревании в смеси 100 мл дистиллированной воды и 2,3 мл ледяной уксусной кислоты. После полного растворения бензидина раствор охлаждают и растворяют в нем 5,45 г трехводного уксус-нокислого натрия. После этого общий объем раствора доводят дистиллированной водой до 400 мл).

2. 0,333 Н перекись водорода (Готовят 0,6% раствор перекиси водорода и концен-трацию перекиси определяют титрованием 0,1 Н раствором перманганата калия. На тит-рование 3,0 мл 0,333 Н перекиси водорода должно идти 10,0 мл 0,1 Н КМnО4. По резуль-татам титрования раствор перекиси водорода доводят до нужной концентрации дистил-лированной водой).

Оборудование и аппаратура.

1.  Спектрофотометр с термостатируемой кюветой.

2.  Секундомер.

3.  Ультратермостат.

4.  Весы аналитические.

5.  Бюретка для титрования.

6.  Пробирки химические.

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит гепаринизированная кровь.

Ход определения.

1. К 0,1 мл основного гемолизата по п. 5.1 "Метода определения активности ката-лазы" прибавляют 19,9 мл дистиллированной воды (рабочий гемолизат).

2. В термостатируемую кювету с ходом луча 10 мм приливают 2,0 мл раствора бен-зидина и 0,5 мл раствора перекиси водорода, предварительно подогретых до 37°С.

3. Перемешивают содержимое кюветы,  открывают шторку камеры фотоэлементов спектрофотометра и, изменяя ширину щели, устанавливают показания спектрофотометра на нулевую отметку шкалы оптической плотности при длине волны 520 нм.

4. В кювету добавляют 0,1 мл рабочего гемолизата, перемешивают и ровно через 1 минуту (по секундомеру) снимают показания оптической плотности опытной пробы.

5. Для учета изменения оптической плотности за счет неферментативного окисле-ния бензидина аналогично опытной пробе проводят измерение оптической плотности контрольной пробы, содержащей вместо рабочего гемолизата 0,1 мл дистиллированной воды.

Расчет результатов.

Активность пероксидазы крови расчитывается по формуле:

27

где

А - активность фермента, ед.опт.пл./л×сек

Ео - оптическая плотность опытной пробы

Ек - оптическая плотность контрольной пробы

16,08×106 - фактор разведения

60 - время проведения реакции, сек

Примечания.

1. Поскольку метод требует определения оптический плотности реакционной сме-си в строго определенный момент времени, целесообразно использовать спектрофотометр с цифровой регистрацией результатов измерений.

2. Пробы гепаринизированной крови можно хранить при 0-4°С в течение 1 суток.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021