27. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ В КРОВИ

Принцип метода. Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 410 нм.

Реактивы.

1. 0,04412 Н раствор перекиси водорода (Готовят примерно 0,08% раствор переки-си водорода и устанавливают точную концентрацию титрованием 0,01 Н раствором КМпО4. На титрование 5 мл 0.04412 Н раствора перекиси водорода должно идти 22,06 мл 0,01 Н раствора перманганата калия. По результатам титрования раствор перекиси водо-рода доводят до нужной концентрации дистиллированной водой).

2. 4,5% раствор аммония молибденовокислого (4,5 г молибдата аммония растворя-ют в 9565 мл дистиллированной воды).

3. 0,1 М трис-HCl буфер, рН 7,4.

4. Буферно-субстратная смесь (10 мл трис-HCl буфера рН 7,4 смешивают с 30 мл 0,04412 Н раствора перекиси водорода).

Оборудование и аппаратура.

1.  Спектрофотометр.

2.  Секундомер.

3.  Баня водяная.

4.  Весы аналитические.

5.  Бюретка.

6.  Пипетки измерительные.

7.  Пробирки  химические.

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит гепаринизированная кровь.

Ход определения.

1. К 0,5 мл гепаринизировашюй крови приливают 3,5 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают и оставляют на 5-10 минут при комнатной температуре (основной гемолизат). К 0,2 мл основного гемолизата прибавляют 3,8 мл воды и тщательно переме-шивают (рабочий гемолизат).

2. В две химические пробирки наливают по 2,0 мл буферно-субстратной смеси и проинкубируют в водяной бане при 37 С в течение 10 минут.

3. В одну из пробирок (опытную) добавляют 0,1 мл рабочего гемолизата, тщатель-но перемешивают и инкубируют в водяной бане при 37°С в течение 3 минут (по секун-домеру).

4. Реакцию останавливают добавлением в опытную пробу 2,0 мл молибдата аммо-ния. Одновременно  приливают в контрольную пробирку сначала 2,0 мл молибдата ам-мония, а затем 0,1 рабочего гемолизата.

5. Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной проб при 410 нм в кювете с ходом луча 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь, состоящую из 1 мл буфера, 3 мл дистиллированной воды и 0,1 мл рабочего гемолизата.

Расчет результатов.

Активность каталазы рассчитывают по формуле:

28

где

А      - активность фермента, М.Е. (мкМ перекиси водорода/л×мин)

Ек    -оптическая плотность контрольной пробы

Ео      - оптическая плотность опытной пробы

4,1     - конечный объем пробы

16×105 - фактор разведения

106      - коэффициент пересчета на мкМ

22,2×106 - коэффициент молярной экстинкции перекиси водорода

3     - время инкубации, мин

Примечания.

1. Пробы гепаринизированной крови можно хранить при +4°С в течение суток.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021