26. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В ЭРИТРОЦИТАХ

Принцип метода. Метод основан на торможении супероксиддисмутазой восста-новления бесцветных тетразолиевых солей супероксидными анионрадикалами при кото-ром происходит их превращение в окрашенные соединения (формазаны).

Реактивы.

1.  0,2 мМ раствор ЭДТА-Na (37 мг ЭДТА-Na2 (трилона Б) растворяют в 500 мл ди-стиллированной воды).

2.  0,05 М раствор тетраметилендиамина (ТЭМЭД) (0,28 мл ТЭМЭД растворяют в 40 мл 0,2 мМ раствора ЭДТА-Na2). Реактив годен для использования через 2 часа после приготовления в течение суток.

3.  0,034 мМ раствор рибофлавина (1,3 мг рибофлавина растворяют при перемеши-вании на магнитной мешалке в течение 20-30 минут в 100 мл дистиллированной воды). Раствор хранится в склянке из темного стекла и годен в течение рабочего дня.

4.  0,85 мМ раствор пара-нитротетразолия хлористого (п-НТХ) (32 мг п-НТХ рас-творяют в 100 мл дистиллированной воды). Реактив растворяется медленно, поэтому можно использовать магнитную мешалку и подогрев до 50 С. Хранится в склянке из темного стекла в течение 1 месяца.

5.  0,1 М фосфатный буфер, рН 7,8 (1,3616 г КН2РО4 растворяют в 100 мл воды, 16,036 г Na2HPO4 × 2Н2О или 32,313г Na2HPO4 × 12Н2О растворяют в 900 мл воды. К од-ной части раствора фосфата калия добавляют 9 частей раствора фосфата натрия и прове-ряют рН на рН-метре.

6.  0,1 М фосфатный буфер, рН 9,85 (Половину приготовленного буфера рН 7,8 по п. 5 оставляют, а другую половину доводят под контролем рН-метра до 9,85 концентри-рованным раствором КОН).

7.  1% раствор йодистого калия.

8.  0,9% раствор хлористого натрия.

9.  Смесь хлороформ-этанол в соотношении 5:3 (по объему).

Оборудование и аппаратура.

1.  Фотоэлектроколориметр.

2.  Лампа дневного света мощностью 40 ватт, длина трубки 1 м и более.

3.  Штатив для пробирок на 20-30 гнезд в один ряд, закрытый спереди и сзади чер-ной бумагой.

4.  Весы аналитические.

5.  Магнитная мешалка.

6.  Секундомер.

7.  Центрифуга рефрижераторная.

8.  Холодильник бытовой.

9.  Водяная баня.

10.  Колбы мерные.

11.  Пробирки химические и центрифужные.

Материал для исследования.

Материалом для исследования служат эритроциты, отмытые трижды от плазмы холодным 0,9% раствором хлористого натрия.

Ход определения.

1. К эритроцитарной массе, полученной после отмывки от плазмы 0,5 мл гепари-низированной крови приливают 5 мл охлажденной до 1 - 4°С дистиллированной воды и оставляют в ледяной бане на 15 минут для более полного гемолиза.

2. 1,5 мл гемолизата переносят в центрифужные пробирки, прибавляют 0,5 мл сме-си хлороформ-этанол, перемешивают и оставляют на 10-15 минут ледяной водяной бане.

3. Пробы центрифугируют при 0-4 С в течение 15 минут при 3000 об/мин.

4. Надосадочную жидкость (бесцветную или слегка желтоватую) разбавляют ди-стиллированной  водой в 20 раз. Половину полученного  биологического материала оставляют в химических пробирках в ледяной водяной бане.

5. Другую половину биологического материала помещают в кипящую водяную баню на 10 минут (вода должна постоянно кипеть) для инактивации фермента.

6. Для каждой пробы берут три химические пробирки, ставят их в закрытый шта-тив и добавляют в них растворы реактивов и биологический материал в порядке и коли-чествах указанных в таблице.

7. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и штатив с ними устанавлива-ют на расстоянии 20 см от лампы дневного света.

8. Включают лампу, прогревают ее в течение 10 минут. Открывают переднюю стенку штатива и облучают пробы в течение 5 минут (по секундомеру) и закрывают пе-реднюю стенку штатива.

9. Во все пробирки добавляют (как можно быстрее) по 1 мл 1% раствора йодистого калия (для остановки реакции) и сразу интенсивно перемешивают.

Таблица

п/п

Реактивы

Опыт

Контроль

Контроль

на реактивы

1.

0,1 М фосфатный буфер, рН 7,8

1,0 мл

1,0 мл

-

2.

0,1 М фосфатный буфер, рН 9,85

-

-

2,0мл

3.

0,05 М раствор ТЭМЭДа

1,0 мл

1,0 мл

-

4.

0,85 М раствор п-нитротетразолия

1,0 мл

1,0 мл

1,0мл

5.

Вода дистиллированная

5,0 мл

5,0 мл

5,0 мл

6.

Биологический материал по п. 5.4

0,2мл

-

-

7.

Биологический материал по п. 5.5

-

0,2 мл

0,2мл

8.

0,034 мМ раствор рибофлавина

2,0 мл

2,0 мл

2,0 мл

10. Измеряют оптическую плотность каждой пробы на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре № 5 в кюветах с ходом луча 20 мм против дистиллированной воды.

11. Количество гемоглобина в гемолизатах определяют гемиглобинцианидным методом с помощью соответствующего набора реактивов.

Расчет результатов.

Находят процент торможения супероксиддисмутазой образования формазана

п-НТХ по формуле:

31

где

Т - процент торможения реакции;

Ек - оптическая плотность контрольной пробы;

Еоп - оптическая плотность опытной пробы;

Екр - оптическая плотность пробы контроля на реактивы.

Принято считать, что 50% ингибирования реакции соответствует одной относи-тельной единице активности фермента.

2. Количество относительных единиц активности фермента, внесенного в пробу, рассчитывают по формуле:

30

где

М - количество относительных единиц активности в пробе;

Т - процент торможения реакции.

3. Активность супероксиддисмутазы в пересчете на содержание гемоглобина рас-считывается по формуле:

29

где

А  - активность супероксиддисмутазы, ед.акт./мг гемоглобина;

М - количество единиц фермента в пробе;

Ест - оптическая плотность стандартного раствора, содержащего 59,75 мг гемогло-бинцианида в 100 мл по п. 5.11;

Егем - оптическая плотность опытной пробы гемолизата при определении гемо-глобина по п. 2

Примечания.

1. Пробы гепаринизированной крови можно хранить при +4°С не более 1 суток.

2. Химические пробирки, в которых ведется определение активности фермента должны иметь одинаковый диаметр, толщину стенок и цвет стекла.

3. В добавке биологического материала должна содержаться примерно 1 единица активности фермента (процент торможения  должен составлять 35-55%).

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021