25. ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ОСНОВАНИЙ ШИФФА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода. Метод основан на измерении флуоресценции соединений типа Шиффовых оснований, извлекаемых липидными растворителями из биологического ма-териала.

Реактивы.

1.  Хлороформ.

2.  Спирт метиловый.

3.  Экстагирующая смесь хлороформ-метанол 2:1 (по объему).

4.  Серная кислота, 0,1 Н.

5. Стандартный раствор хинин-сульфата (10 мг хинин-сульфата растворяют в 10 мл 0,1 Н раствора серной кислоты). Раствор может хранится в холодильнике в посуде из темного стекла в течение месяца.

Оборудование и аппаратура.

1.  Спектроколориметр "Спекол-10" с приставкой для измерения флуоресценции или спектрофлуорометр любой модели.

2.  Весы аналитические.

3.  Холодильник бытовой.

4.  Центрифуга лабораторная.

5.  Баня водяная .

6.  Пипетки измерительные.

7.  Колбы мерные.

8. Пробирки химические и центрифужные.

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит сыворотка крови.

Ход определения.

1. В центрифужную пробирку  вносят 1 мл сыворотки крови и приливают по 4 мл смеси хлороформ-метанол. Пробы тщательно перемешивают стеклянной палочкой.

2. Пробирки плотно закрывают корковыми пробками, помещают в водяную баню на 5 минут при температуре 30°С. Вынимают из бани и интенсивно встряхивают в тече-ние 1 минуты.

3. Пробы центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об/мин.

4. Верхний водно-спиртовой слой осторожно отсасывают. Осадок белка протыка-ют стеклянной палочкой. Нижний хлороформный экстракт фильтруют в чистые пробир-ки через смоченный хлороформом  бумажный фильтр.

5. Измеряют флуоресценцию хлороформных экстрактов при длине волны возбуж-дения равной 365-370 нм и длине волны испускания 435-440 нм. Флуоресценцию стан-дартного раствора измеряют после его разведения в 1000 раз до концентрации 1 мкг/л. Также измеряют флуоресценцию чистого хлороформа.

Расчет результатов.

Содержание флуоресцирующих оснований Шиффа рассчитывают по формуле:

32

где

А - содержание оснований Шиффа, отн.ед./мл сыворотки;

Ео - флуоресценция опытной пробы;

Ест - флуоресценция стандартного раствора хинин-сульфата, принятая за 1 едини-цу;

Ек- флуоресценция чистого хлороформа.

Примечание.

1.  Сыворотку можно хранить в холодильнике не более 1 суток.

2.  Хлороформ перед использованием очищают перегонкой.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021