22. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА Е В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода. Метод основан на определении ионов двухвалентного железа, образующихся при взаимодействии токоферолов с хлорным железом, в виде окрашенного комплекса Fe2+ с ортофенантролином (ОФ) или батофенантролином (БФ).

Реактивы.

1. Спирт этиловый, 96% по ГОСТ Р 51652-2000.

2. Гексан, х.ч.

3. Бензол перегнанный.

4. 0,025%-ный раствор хлорного железа в эталоне (25 мг FeCl3 растворяют в 10 мл этанола и этот раствор разводят этанолом еще в 10 раз). Раствор готовится в день прове-дения анализов. Годен в течение рабочего дня.

5. 0,05%-ный раствор орто- или батофенантролина в этаноле (25 мг ОФ или БФ растворяют в 10 мл этанола в этот раствор разводят еще в 5 раз). Раствор готовится в день проведения анализов. Годен в течение рабочего дня.

Оборудование и аппаратура.

1. Спектрофотометр любой марки.

2. Весы аналитические по ГОСТ 24104-2001.

3. Баня водяная.

4. Центрифуга.

5. Секундомер.

6. Баллон с газообразным азотом.

7. Пипетки измерительные.

8. Пробирки центрифужные и химические.

9. Пробирки с притертыми пробками

Материал для исcледования.

Материалом для исследования служит сыворотка крови.

Ход определения.

1. В пробирки с притертыми пробками вносят по 1 мл сыворотки крови и прили-вают по 1 мл этилового спирта. Тщательно перемешивают стеклянной палочкой.

2. К пробам добавляют 3 мл гексана и энергично встряхивают в течение 2-х минут.

3. Пробы после встряхивания переносят в центрифужные пробирки и центрифу-гируют в течение 10 минут при 2500-3000 об/мин.

4. Из верхнего гексанового слоя отбирают по 2 мл, переносят в четыре химические пробирки и в них выпаривают гексан в токе азота на водяной бане при температуре 50°С.

5. Сухой остаток растворяют в 1 мл бензола, прибавляют по 1 мл 0,025%-ного рас-твора хлорного железа и выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут.

6. К пробам (по одной) приливают по 1 мл 0,05%-ного раствора ортофенантролина (или батофенантролин) и ровно через 2 минуты (по секундомеру) измеряют оптическую плотность (Еоп) при длине волны 510 нм (при использовании ортофенантролина) или при 535 нм (при использовании батофенантролина) против пробы – содержащей 1 мл бензола в 2 мл этилового спирта.

7. Одновременно с опытными ставят контрольную пробу, содержащую 1 мл бензо-ла, 1 мл раствора хлорного железа, 1 мл раствора орто- или батофенантролина. Оптиче-скую плотность контрольной пробы (Еп) измеряют также через 2 минуты по секундомеру после добавления ОФ или БФ.

8. При определении витамина Е в сыворотке крови крупного рогатого скота, со-держащей много каротина, после центрифугирования верхний гексановый слой по воз-можности максимально переносят в чистые химические пробирки и измеряют оптиче-скую плотность проб при 462 нм против чистого гексана (Е462). Далее отбивают по 2 мл гексанового экстракта, переносят его в новые химические пробирки и далее продолжают согласно п.4.

Построение калибровочного графика.

4,31 мг альфа-токоферола растворяют в 100 мл бензола (концентрация полученно-го раствора - 100 мкМ/л). Из этого раствора готовят основной раствор с концентрацией альфа-токоферола - 40 мкМ/л. Из основного раствора путем разбавления бензолом готовят рабочие стандартные растворы в интервале концентраций 30-1 мкМ/л. Для построения калибровочной кривой берут по 1 мл каждого из стандартных рабочих растворов (в двух-трех повторностях) прибавляют по 1 мл 0,025%-ного раствора хлорного железа и далее обрабатывают также как и опытные пробы согласно п.6. На миллиметровой бумаге по оси абсцисс откладывают значения концентраций стандартных растворов, а по оси орди-нат - соответствующие им значения оптических плотностей (Е) равных разнице между оптической плотностью каждого стандартного раствора и оптической плотностью кон-трольной пробы.

Расчет результатов.

Количество витамина Е, участвующего в реакции, определяют по калибровочному графику, учитывая, что:

– для свиней, овец, птиц Е = Еоп - Ек

– для крупного рогатого скота Е = (Еоп - Ек) - (Е462  0,270)

Концентрацию витамина Е в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

35

С - содержание витамина Е в сыворотке, мкМ/л;

А - количество витамина Е, найденное по калибровочной кривой;

3 - общее количество гексанового экстракта;

2 - объём выпаренного гексанового экстракта.

Примечание:

1. Сыворотка может храниться в холодильнике при 0-4°С в течение двух недель.

2. Пробы при исследовании необходимо беречь от прямого попадания света.

 

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021