21. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА С В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Принцип метода. Аскорбиновая кислота восстанавливает трехвалентное железо в двухвалентное. Последнее образует с a¢a¢--дипиридилом комплексное соединение розово-го цвета.

Реактивы.

1. 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты. 5 г ТХУ растворяют в 95 мл дистил-лированной воды.

2. 40%-ный раствор трихлоруксусной кислоты. 40 г ТХУ растворяют в 60 мл ди-стиллированной воды.

3. 3%-ный раствор хлорного железа. Хранится не более 3 уток. 1,5 г хлорного же-леза растворяют в 50 мл дистиллированной воды.

4. 1%-ный раствор -дипиридила. В воде -дипиридил растворяется плохо, поэтому навеску его необходимо смочить 96%-ным этиловым спиртом. К 0,5 г -дипиридила прилить 4 мл спирта, а затем в мерной колбе на 50 мл долить бидистиллиро-ванной водой до метки.

5. 85%-ная фосфорная кислота (орто).

6. Аскорбиновая кислота.

Оборудование и аппаратура.

1. Фотоэлектроколориметр.

2. Центрифуга.

3. Центрифужные пробирки.

4. Колбы мерные на 50 и 100 мл  по ГОСТ 1770.

5. Пипетки градуированные на 0,1, 1 и 2 мл

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит плазма крови.

Ход определения.

1. К 2 мл плазмы добавляют 0,3 мл охлажденного 40%-ного раствора трихлорук-сусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 10 минут на холоде (в воде со льдом) с целью более полной денатурации белков.

2. Центрифугируют 20 минут при 2000 об/мин.

3. К 1 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,5 мл бидистиллированой воды, 0,1 мл 85%-ной фосфорной кислоты (орто), 0,8 мл 1%-ного раствора -дипиридила и 0,1 мл 3%-ного раствора хлорного железа. Содержимое пробирки после добавления каждого реактива тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для проявления окраски. Окраска стабильна в течение суток.

4. По истечении 30 минут пробы центрифугируют 5 минут при 2000 об/мин и ко-лориметрируют на ФЭКе при длине волны 525 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 5 мм против контрольной пробы (вместо надосадочной жидкости берут дистиллированную воду, а затем поступают так же, как с опытными пробами).

Расчет результатов.

1. Расчет содержания витамина С производят с помощью калибровочного графика. 33,3 мг аскорбиновой кислоты растворяют в 100 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. 10 мл этого раствора вносят в мерную колбу на 100 мл и доливают до метки 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты.

2. В 6 мерных колбах на 1,0 мл вносят последовательно 4, 6, 8, 10, 20, 30 мл стан-дартного раствора и доводят до метки дистиллированной водой.

3. По 1,5 мл раствора из каждой колбочки вносят в центрифужные пробирки, при-бавляют по 0,1 мл 85%-ной фосфорной кислоты (орто), 0,8 мл 1%-ного раствора -дипиридила и 0,1 мл 3%-ного раствора хлорного железа, перемешивают и оставляют на 30 минут для проявления окраски.

4. Перед колориметрированием пробы центрифугируют 5 минут при 2000 об/мин. Полученные результаты изображают графически на миллиметровой бумаге.

Примечания:

1. Стандартные растворы аскорбиновой кислоты нестойки. Их готовят непосред-ственно перед исследованием. Содержание витамина С в плазме крови при её хранении в холодильнике снижается.

2. Содержание витамина С в сыворотке крови значительно ниже, чем в плазме.

3. Определение содержания витамина С необходимо проводить в свежей плазме, отделенной от форменных элементов в течение 4-х часов после отбора проб крови.

ЗНАЧЕНИЕ. Содержание витамина С в плазме здоровых животных представлено в таблице 2 Приложения.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021