18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТ- И АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода. В результате переаминирования, происходящего под действием АсАТ и АлАТ, образуется 2-оксоглутаровая и пировиноградная кислоты. 2-оксоглу-таровая кислота способна в процессе ферментативной реакции превращаться в пировино-градную кислоту. При добавлении 2,4-динитрофенил-гидразина в щелочной среде обра-зуются окрашенный гидразон пировиноградной кислоты, интенсивность окраски которо-го пропорционально количеству образовавшейся пировиноградной кислоты.

18.1. Определение активности аспартатаминотрансферазы.

Реактивы.

1. 0,1 моль раствор фосфатного буфера, рН = 7,4 (17,4 г Na2HPО4•2Н2О доводят ди-стиллированной водой до 1000 мл 13,6 н КН2РО4 доводят до 1 л дистиллированной во-дой. Смешивают 840 мл 0,1 Моль раствора Na2HPО4 и 160 мл 0,1 моль раствора КН2РО4). Величину рН буфера доводят до 7,4 с помощью рН-метра.

2.Субстратный раствор для определения активности аспартатаминотрансферазы: 29,2 мг -кетоглутаровой и 2,66 г DL-аспарагиновой кислот растворяют в 1 н растворе NaOH. Едкий натр прибавляют осторожно, до получения рН=7,4. Объём доводят до 100 мл фосфатным буфером.

3. 1 н раствор NaOH. 4 г NaOH растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

4. Раствор 2,4-динитрофенилгидразин. 1,8 мг 2,4-динитрофенилгиразина раство-ряют в 1 н растворе соляной кислоты. Доводят объем до 100 мл.

5. 0,4 н раствор NaOH. 16 г NaOH растворяют в 1000 мл дистиллированной воды.

6. Стандартный раствор пировинограднокислого натрия, для приготовления ка-либровочного раствора (11 мг кристаллического пирувата натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 110 мкг пирувата натрия, что соответ-ствует 88 мкг или 1 мкМоль пировиноградной кислоты).

Оборудование и аппаратура.

1. Спектрофотометр.

2. Весы аналитические по ГОСТ 24104-2001.

3. Ультратермостат.

4. Секундомер.

5. рН-метр.

6. Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

7. Пробирки Флоринского.

8. Дозатор по ГОСТ 1770.

9. Колбы мерные 100, 500, 1000 мл по ГОСТ 1770.

10. Унипипетки на 50, 100, 250, 500 мкл и наконечники к ним.

11. Флаконы на 100, 500, 1000 мл.

12. Штатив для пробирок.

13. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит сыворотка крови без следов гемолиза.

Ход определения.

п/п

Реактивы в мл

Опыт

Стандарт

Контроль

1.

Субстрат АсАТ

0,25

0,25

0,25

Термостатируют 3-5 минут при температуре 37°С

2.

Сыворотка без гемолиза

0,05

3.

Стандартный раствор

0,05

Инкубируют 60 мин при температуре 37°С

4.

2,4-ДНФГ

0,25

0,25

0,25

5.

Сыворотка

0,05

Выдерживают 20 минут при комнатной температуре

6.

0,4 н раствор NaOH

2,5

2,5

2,5

Тщательно перемешивают и оставляют для развития окраски на 10 минут при ком-натной температуре. Определяют оптическую плотность при длине волны 530 нм (зеле-ный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против контрольной (холостой) пробы, которую ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет результатов.

Расчет активности фермента в сыворотке крови производят по калибровочной кривой. Из калибровочного раствора готовят ряд разведении как указано в таблице.

Таблица

п/п

Калиб. р-р, мл

Вода, мл

Пируват

Активность,

нмоль/с×л

мкг

мкмоль

   1.                            0,05                            0,55                             4,4                       0,05                       139

   2.                          0,1                                  0,5                            8,8                         0,1                         278

   3.                           0,15                              0,45                          13,2                      0,15                        417

   4.                           0,2                                0,4                            17,6                      0,2                           556

   5.                           0,25                             0,35                            22,0                      0,25                       695

Калибровочные пробы ставят так же, как опытные, но вместо сыворотки добавля-ют разведенные калибровочные растворы. Измеряют против контрольной (холостой) пробы, в которую вместо калибровочных растворов добавляют воду. Калибровочная кри-вая линейна до величины экстинкции 0,3.

18.2. Определение активности аланинаминотранасферазы

в сыворотке крови

Реактивы.

1. 0,1 моль/л раствор фосфатного буфера, рН=7,4 (14,2 г Na2HPО4 2Н2О доводят дистиллированной водой до 1000 мл., 13,6 г КН2РО4 доводят до 1 л дистиллированной водой, смешивают 840 мл 0,1 моль/л раствора Na2HPО4 и 160 мл 0,1 моль/л раствора КН2РО4, величину рН буфера доводят под контролем рН-метра).

2. Субстратный раствор для определения активности аланинаминотрансферазы: 29,2 мг -кетоглутаровой кислоты и 1,78 г DL-аланина растворяют в фосфатном буфере, доводят щелочью до рН 7,4 и объем до 100 мл.

3. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина. 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина рас-творяют в 1 н растворе соляной кислоты, доводят объем кислотой до 100 мл.

4. 0,4 н раствор NaOH.

5. Стандартный раствор пирувата натрия. Для приготовления калибровочного рас-твора 11 мг кристаллического пирувата натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 110 мкг пирувата натрия, что соответствует 88 мкг или 1 мкМоль пировиноградной кислоты.

Оборудование и аппаратура.

1. Спектрофотометр.

2. Весы аналитические по ГОСТ 24104-2001.

3. Ультратермостат.

4. Секундомер.

5. рН-метр.

6. Пробирки Флоринского.

7. Колбы мерные 1 л, 100 мл, 500 мл по ГОСТ 1770.

8. Дозатор по ГОСТ 1770.

9. Унипипетки на 500, 100, 50, 250 мкл и наконечники к ним.

10. Флаконы 100, 500, 1000 мл.

11. Штатив для пробирок.

12. Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

13. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит сыворотка крови, свободная от гемолиза.

Ход определения.

п/п

Реактивы, мл

Опыт

Стандарт

Контроль

1.

Субстрат АлАТ

0,25

0,25

0,25

Термостатируют 3-5 минут при температуре 37 °С

2.

Сыворотка без гемолиза

0,05

3.

Стандартный раствор

0,05

Инкубируют 60 мин при температуре 37 °С

4.

2,4-ДНФГ

0,25

0,25

0,25

5.

Сыворотка

0,05

Выдерживают 20 минут при комнатной температуре

6.

0,4 н раствор NaOH

2,5

2,5

2,5

Тщательно перемешивают и оставляют для развития окраски на 10 минут при ком-натной температуре. Определяют оптическую плотность при длине волны 530 нм (зеле-ный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против контрольной (холостой) пробы, которую ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет результатов.

Расчет активности фермента в сыворотке крови производят по калибровочной кривой. Построение калибровочного графика: из калибровочного раствора готовят ряд разведения как указано в таблице.

Таблица

п/п

Калиб. р-р, мл

Вода, мл

Пируват

Активность,

нмоль/с×л

мкг

мкмоль

   1.                               0,05                             0,55                          4,4                       0,05                         278

   2.                              0,1                                  0,5                          8,8                       0,1                           556

   3.                              0,15                              0,45                          13,2                       0,15                       834

   4.                                0,2                               0,4                         17,6                        0,2                          1112

   5.                               0,25                             0,35                          22,0                      0,25                        1390

Калибровочные пробы ставят так же, как опытные, но вместо сыворотки добавля-ют разведенные калибровочные растворы. Измеряют против контрольной (холостой) пробы, в которую вместо калибровочных растворов добавляют воду. Калибровочная кри-вая линейна до величины экстинкции 0,3.

ЗНАЧЕНИЕ. Определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспар-татаминотрансферазы (АсАТ) позволяет диагностировать гепатопатию и миопатию. Очень высокое значение АлАТ указывает на некроз печёночных клеток любой этиоло-гии, обширную травму, миозит, миокардит. При гепатите резко повышается активность АлАТ, тогда как поражение миокарда сопровождается преимущественно возрастанием активности АсАТ.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021