16. ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АТФаз В ГЕМОЛИЗАТЕ ЭРИТРОЦИТОВ

Принцип метода. Метод основан на определении неорганического фосфора, обра-зующегося при инкубации гемолизата эритроцитов с АТФ. Активность общей (Мg2+, Na+, K+) – АТФазы определяется в присутствии ионов Mg2+, Na+, K+. Активность Мg2+-АТФазы  - только с ионами магния; Na+, K+ -АТФазы – по разнице между общей активно-стью и активностью Мg2+- АТФазы. Одновременно с определением АТФазной активно-сти рекомендуется определять содержание гемоглобина в гемолизатах эритроцитов. Это связано с тем, что гемоглобин является основным белком гемолизата эритроцитов, а так-же образует комплекс с АТФ и другими нуклеотидами. АТФазная активность связана с количеством эритроцитов, поэтому необходимо определять их общий объем (гематокрит) или количество эритроцитов.

Ход определения.

1. Гепаринизированную кровь центрифугируют при 4 000 об/мин, 10 мин. Эрит-роциты отделяют от плазмы и гемолизируют охлажденной бидистиллированной водой 1:4.

2. В таблице приведены состав инкубационной среды и протокол проведения ис-следования. Максимальная активность общей Мg2+, Na+, K+-АТФазы выявляется при 5 мкМ АТФ в растворе.

Таблица

Состав инкубационной среды и ход определения активности АТФаз

Компонент инкубационной среды

без Na+ и K+

с Na+ и K+

контроль

опыт

контроль

опыт

в мл

0,1 М трис-буфер, рН 7,6

1,5

1,5

1,0

1,0

0,006 М р-р MgCl2

0,25

0,25

-

-

0,006 М р-р MgCl2;

     0,1 М р-р NaCl;

     0,02 М р-р КСl

-

-

0,75

0,75

20 мМ р-р АТФ (АТФ-Na2)

-

0,25

-

0,25

Гемолизат эритроцитов

1,0

1,0

1,0

1,0

 

Инкубация при 37°С, 1 час

30 %-ный р-р ССl3СООН

0,5

0,5

0,5

0,5

20 мМ р-р АТФ (АТФ-Na2)

0,25

-

0,25

-

3. После инкубации белковый осадок отделяют фильтрованием или центрифуги-рованием. Для определения неорганического фосфора берут 0,4 мл фильтрата, 1,5 мл ва-надат-молибдатной смеси и доводят объем жидкости в пробирках до 4 мл бидистиллиро-ванной водой, затем приливают 0,5 мл восстановителя и доводят объем до 5 мл ванадат-молибдатной смесью. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Для развития окраски пробы оставляют стоять на 30 мин при комнатной температуре. Таким же обра-зом обрабатывают стандарт (КН2РО4), содержащий 10 мкг фосфора.4. Определяют опти-ческую плотность опытных и контрольных проб против смеси реактивов на фосфор, при λ = 735 нм, кювета 10 мм (на фотоэлектроколориметре светофильтр № 9, кювета 5 мм).

Расчет результатов.

Расчет активности АТФаз проводят по формуле:

38

где

А     – активность АТФазы, в мкг неорганического фосфора (ФН)на 1 мл эритро-цитов за 1 час;

10     – концентрация стандартного раствора фосфора, мкг

ЕОП     – оптическая плотность опытной пробы;

ЕК    – оптическая плотность контрольной пробы;

ЕСТ      – оптическая плотность стандартного раствора;

5    –  разведение гемолизата;

2,5        – для определения брали 0,4 мл фильтрата (до 1 мл = 0,4×2,5);

4,5        – объем инкубационной пробы (разведение при инкубации)

АТФазная активность может выражаться в мкг ФН на 1 мл эритроцитов за 1 час или мкг ФН на 1 г гемоглобина эритроцитов/час.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021