8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ В КРОВИ

Принцип метода.

Из молочной кислоты в присутствии серной и фосфорной кислот и солей меди об-разуется уксусный альдегид, который, реагируя с параоксидифенилом, даёт продукты окрашенные в фиолетовый цвет. Реакция очень чувствительна, поэтому надо строго вы-держивать все условия выполнения исследования.

Реактивы.

1. 0,5 н раствор едкого натра (20 г едкого натра растворяют в 1 л дистиллированной воды).

2. 10%-ный раствор сернокислого цинка (96 г сернокислого цинка растворяют в 1 л дистиллированной воды).

3. Концентрированная серная кислота (от её качества зависит возможность выпол-нения анализа)

4. Медно-фосфорный реактив (смесь из 3 г медного купороса и 9 мл орто-фосфорной кислоты, должен образоваться гомогенный раствор, на что уходит некоторое время).

5. 1,5%-ный раствор параоксидифенила в диметилформамиде (растворяют 15 мг параоксидифенила в 1 мл диметилформамиде).

6. 5 мМоль/л стандартный раствор молочной кислоты (0,564 г лактата натрия рас-творяют в 1 л дистиллированной воды).

Оборудование и аппаратура.

1. Фотоэлектроколориметр.

2. Центрифуга.

3. Водяная баня.

4. Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

5. Весы аналитические по ГОСТ 24104-2001.

6. Пробирки Флоринского.

7. Секундомер.

8. Химические пробирки тонкостенные на 10 мл для центрифуги.

9. Колбы мерные на 500, 1000 мл по ГОСТ 1770.

10. Мерные цилиндры на 10, 100 мл по ГОСТ 1770.

11. Унипипетки на 50, 100, 500, 1000 мкл и наконечники к ним.

12. Флаконы на 1 л, 10 мл, 50, 500 мл

13. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит цельная кровь.

Ход определения.

1. Ход определения с депротеинизацией:

п/п

Реактивы, мл

Проба

Стандарт

Контроль

1.

0,5 н раствор едкого натра

0,5

0,5

0,5

2.

Цельная кровь

0,5

-

-

3.

Стандартный раствор молочной кислоты 5 мМ/л

-

0,5

-

4.

Дистиллированная вода

1,0

1,0

1,5

5.

10%-ный раствор сернокислого цинка

0,5

0,5

0,5

2. Перед добавлением сернокислого цинка все компоненты № 1-4 тщательно пере-мешиваем и выдерживаем при комнатной температуре в течение 15-30 минут.

3. Затем приливают раствор № 5 и тщательно перемешивают содержимое проби-рок стеклянной палочкой до образования гомогенной смеси и через 30 минут центрифу-гируют при 3000 об./мин в течение 10 минут. Супернатант должен быть прозрачным.

4. Постановка цветной реакции:

п/п

Реактивы, мл

Проба

Стандарт

Контроль

     1.

Безбелковый супернатант крови

0,05

-

-

     2.

Дистиллированная вода

-

-

0,05

     3.

Стандартный раствор молочной кислоты

-

0,05

-

     4.

Медно-фосфорный реактив

0,05

0,05

0,05

     5.

Серная кислота

2,5

2,5

2,5

5. Энергично встряхивают и через 3 минуты ставят на 3 минуты в кипящую водя-ную баню, затем 3 минуты охлаждают в ледяной воде. Добавляют 1 каплю раствора пара-оксидифенила в диметилформамиде, эта капля должна сразу попасть в центр пробирки; встряхивают и оставляют стоять 10 минут при комнатной температуре. После этого нагревают на кипящей водяной бане 90 секунд, охлаждают в воде и фотометрируют в кюветах объемом 2,5 мл при длине волны 565 нм против контроля.

Расчет результатов.

Концентрацию молочной кислоты рассчитывают по формуле:

42

Х    - концентрация опытной пробы;

Еoп - экстинкция опытной пробы;

Ест   - экстинкция стандартной пробы;

5 мМ/л - концентрация стандартной пробы

Примечания.

1. Для определения молочной кислоты в крови используют тот же безбелковый супернатант крови, что и для определения глюкозы.

2. Стандартный раствор молочной кислоты готовят непосредственно перед прове-дением анализа.

3. Качество серной кислоты при постановке реакции имеет решающее значение. Поэтому реактив подбирают заранее, испытывая различные партии реактива для получе-ния максимальной окраски раствора.

ЗНАЧЕНИЕ. Содержание молочной кислоты в крови повышается при ацидозе рубца, поедании большого количества свеклы, зелёной массы кукурузы молочно-восковой спелости, зерновых злаков, содержащих много крахмала. Гиперлактатемия встречается при миоглобинурии, диабете, эндогенной остеодистрофии бычков при ин-тенсивном их выращивании и откорме, когда болезнь сопровождается ацидозом рубца и всасыванием в кровь большого количества молочной кислоты., а также при гипоксиях различного происхождения, когда понижается содержание глюкозы в крови и преоблада-ет анаэробный гликолиз.

 

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021