7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ В КРОВИ

Принцип метода. Пировиноградная кислота с 2,4-динитрофенилгидразином в ще-лочной среде образует окрашенные гидразоны, интенсивность окраски пропорциональна содержанию пирувата.

Реактивы.

1. 0,5 н раствор едкого натра (20 г едкого натра растворить в 1 л дистиллирован-ной воды).

2. 10%-ный раствор сернокислого цинка (96 г сернокислого цинка растворяют в 1 л дистиллированной воды).

3. 0,15%-ный раствор 2,4-динитрофенилгидразина (150 мг 2,4-динитрофенилгид-разина растворяют при нагревании в 10 мл концентрированной соляной кислоты, дово-дят дистиллированной водой до 100 мл).

4.15%-ный раствор едкого натра (15 г едкого натра растворяют в 85 мл дистилли-рованной воды).

5. Концентрированная соляная кислота.

6. Стандартный раствор пирувата Na (47,3 мг пирувата натрия растворяют в мер-ной колбе на 1 л дистиллированной водой. Раствор содержит 250 мкМ пировиноградной кислоты. Раствор используют для построения калибровочной кривой для каждой новой партии реактивов, в качестве рабочего стандартного раствора каждой серии определений применяют раствор содержанием пировиноградной кислоты - 100 мкМ/л).

Оборудование и аппаратура.

1. Спектрофотометр.

2. Центрифуга.

3. Холодильник бытовой по ГОСТ  16317.

4. Весы аналитические по ГОСТ 24104-2001.

5. Секундомер.

6. Химические пробирки тонкостенные на 10 мл для центрифуги.

7. Пробирки Флоринского.

8. Штативы для пробирок.

9. Мерные колбы на 100, 1000 мл по ГОСТ 1770.

10. Мерные цилиндры на 100, 500 мл по ГОСТ 1770.

11. Флаконы на 50, 100, 250, 500, 1000 мл

12. Стеклянная палочка

13. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

14. Пипетки на 1000, 500, 250, 100, 50 мкл и наконечники к ним.

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит цельная кровь.

Ход определения.

1. Ход работы с депротеинизацией:

п/п

Реактивы, мл

Проба

Стандарт

Контроль

1.

0,5 н раствор едкого натра

0,5

0,5

0,5

2.

Цельная кровь

0,5

-

-

3.

Стандартный раствор пирувата Na 100 мкМ/л

-

0,5

-

4.

Дистиллированная вода

1,0

1,0

1,5

5.

10%-ный раствор сернокислого цинка

0,5

0,5

0,5

2. Перед добавлением сернокислого цинка все компоненты № 1-4 тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 15-30 минут.

3. Затем приливают реактив № 5 и тщательно перемешивают содержимое проби-рок стеклянной палочкой до образования гомогенной смеси и через 30 минут центрифу-гируют при 3000 об./мин. в течение 10 минут. Супернатант должен быть прозрачным.

4. Постановка цветной реакции:

п/п

Реактивы, мл

Проба

Стандарт

Контроль

   1.                        Безбелковый супернатант крови                                    0,5                          -                             -

   2.                       Дистиллированная вода                                                      -                            -                          0,5

   3.                      Стандарт пирувата 100 мкМ/л                                            -                          0,5                           -

   4.                    2,4-динитрофенилгидразин                                                 0,1                       0,1                          0,1

   5.              Перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 20 минут

   6.                      15%-ный раствор едкого натра                                         0,25                      0,25                        0,25

Через 5 минут фотометрируют при 530 нм против контроля в 1 см кювете.

Расчет результатов.

Производят по формуле:

43

Сoп. - концентрация опытной пробы;

Еoп. - экстинкция опытной пробы;

Ест. - экстинкция стандартной пробы;

Примечание.

Для определения пировиноградной кислоты в крови используют тот же безбелко-вый супернатант, что и для определения глюкозы.

ЗНАЧЕНИЕ. Содержание пировиноградной кислоты повышается при заболева-нии печени (поздняя стадия), тяжелой сердечной недостаточности, уремии, отравлении тяжелыми металлами, сахарном диабете, гиповитаминозе B1, кетозе и других нарушениях углеводного обмена.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021