6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ

Принцип метода.

Глюкоза окисляется кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозоок-сидазы с образованием перекиси водорода и -глюконолактона. Образовавшуюся пере-кись водорода определяют по индофеноловой реакции аминоантипирина с хромогеном, катализируемой пероксидазой. Количество образовавшегося красителя при соблюдении рабочих условий пропорционально содержанию глюкозы.

Реактивы.

1. 0,5 н раствор едкого натра (20 г едкого натра растворяют в 1 л дистиллирован-ной воды).

2. 10%-ный раствор сернокислого цинка (96 г сернокислого цинка, содержащего 7 молекул воды растворяют в 1 л дистиллированной воды).

3. Набор реактивов «Глюкоза ферментативно».

4. Рабочий раствор: содержимое флаконов «Смесь ферментов», «Хромоген» рас-творяют примерно в 50 мл бидистиллированной воды, добавляют 18 мл концентрирован-ного буферного раствора и доливают бидистиллированной воды до 500 мл (рН рабочего раствора 8,3). Хранят в темной банке при температуре от 0°С до +10°С.

5. Стандартный раствор глюкозы. Раствор с содержанием глюкозы 25 мМ/л разво-дят дистиллированной водой в 5 раз (5 мМ/л).

Количество необходимых реактивов на 100 анализов.

1. 0,5 н раствор едкого натра            - 60 мл

2. Раствор сернокислого цинка         - 60 мл.

3. Рабочий раствор                 - 120 мл

4. Стандартный раствор глюкозы         - 5 мл

Оборудование и аппаратура.

1. Спектрофотометр.

2. Ультратермостат.

3. Центрифуга.

4. Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

5. Весы аналитические по ГОСТ 24104-2001.

6. рН-метр.

7. Пипетки на 1000, 500, 100, 50 мкл и наконечники к ним.

8. Химические пробирки тонкостенные на 10 мл для центрифуги.

9. Пробирки Флоринского.

10. Колбы мерные на 500, 1000 мл по ГОСТ 1770.

11. Флакон из темного стекла.

12. Секундомер.

13. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

14. Штативы для пробирок.

15. Стеклянная палочка.

16. Флаконы на 1 литр.

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит стабилизированная кровь.

Ход определения.

1. Ход работы с депротеинизацией:

п/п

Реактивы, мл

Проба

Стандарт

Контроль

1.

2.

3.

4.

5.

0,5 н раствор едкого натра

Цельная кровь

Стандартный раствор глюкозы 5 мМ/л

Дистиллированная вода

10%-ный раствор сернокислого цинка

0,5

0,5

-

1,0

0,5

0,5

-

0,5

1,0

0,5

0,5

-

-

1,5

0,5

2. Перед добавлением сернокислого цинка все компоненты № 1-4 тщательно пере-мешиваются и выдерживаются при комнатной температуре 15-30 минут.

3. Затем приливают реактив № 5 и тщательно перемешивают содержимое проби-рок стеклянной палочкой до образования гомогенной смеси и через 30 минут центрифу-гируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант должен быть прозрачным.

4. Постановка цветной реакции:

 

п/п

Реактивы в мл

Проба

Стандарт

Контроль

   1.

   2.

   3.

   4.

Рабочий раствор

Безбелковый супернатант крови

Супернатант стандартного р-ра глюкозы

Супернатант контроля

1,0

0,1

-

1,0

-

0,1

-

1,0

-

-

0,1

 

5. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют 30 минут (точно!) при 37°С, после чего сразу же определяют оптическую плотность против раствора контроля (сравнения) при 490 нм в 1 см кювете.

Расчеты результатов.

Содержание глюкозы (Х) в мМоль/л в пробах рассчитывают по формуле:

44

где

Х   - концентрация глюкозы в крови;

Eoп. - экстинкция опытной пробы;

Ест. - экстинкция стандарта.

Примечания.

1. Постанову цветной реакции проводят добавлением супернатанта к уже отме-ренному рабочему раствору, прогретому в течение 5 минут при 37°С.

2. Цветную реакцию ставят сериями по 5-7 проб с интервалом между сериями 5 минут.

3. В первую очередь ставят реакцию с раствором - контроль (сравнение).

4. Правильность приготовления растворов едкого натра и сернокислого цинка проверяют титрованием по фенолфталеину. Нейтрализация должна происходить объём в объём.

5. В случае невозможности доставить кровь в лабораторию не позднее 1 часа с мо-мента взятия, её фиксируют на месте добавлением 0,5 мл крови к 0,5 мл едкого натра.

ЗНАЧЕНИЕ: Определение глюкозы в плазме или сыворотке крови позволяет по-лучить представление об уровне энергетического метаболизма у с.-х. животных. Опреде-ление глюкозы важно для диагностики кетоза дойных коров и овцематок, а также гипо-гликемии поросят.

Гипогликемия встречается при кетозе, вторичной остеодистрофии, послеродовом парезе, при недостатке микроэлементов, ацидозе, гипокинезии, токсическом поражении печени. Часто она является следствием недостатка в кормах легко усвояемых углеводов, особенно при высококонцентратном типе кормления, преобладании в рационе кислых кормов.

Алиментарная гипергликемия наблюдается при скармливании скоту больших ко-личеств сахаристых кормов (свёклы, патоки), а также при сильном стрессе, возбуждении, высокой температуре, сахарном диабете.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021