4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ

Принцип метода. Компоненты белковой смеси мигрируют в электрическом поле в направлении и со скоростью, зависящими от заряда их молекул. В результате смесь де-лится на фракции, которые можно выявить и измерить количественно.

Реактивы.

1. Веронал-мединаловый буфер рН=8,6 (9,3 г веронала и 51,5 г мединала раство-ряют в 2 л дистиллированной воды, через сутки буферный раствор профильтровать и раз-вести в 2 раза).

2. 1%-ный раствор агарового геля (1 г агара растворяют в 100 мл веронал-меди-налового буфера рН=8,6 и выдерживают на кипящей водяной бане 2 часа, затем охла-ждают гель до 50°С и выдерживают в термостате 1 час при температуре 50°С, для вырав-нивания температуры геля).

3. 20% раствор уксусной кислоты (400 г ледяной уксусной кислоты растворяют в 2 л дистиллированной воды).

4. Фиксирующий раствор (300 мл этилового спирта и 100 мл 20%-ного раствора уксусной кислоты).

5. Раствор для окраски гелей (1 г бромфенолового синего, 500 мл этилового спир-та, 100 мл ледяной уксусной кислоты и 400 мл дистиллированной воды).

6. 7% раствор уксусной кислоты (140 г ледяной уксусной кислоты растворяют в 2 л дистиллированной воды)

7. 0,25 н раствор КОН.

Оборудование и аппаратура.

1. Прибор для электрофореза.

2. Источник постоянного тока.

3. Дозатор по ГОСТ 1770.

4. Весы аналитические по ГОСТ 24104-2001.

5. Термостат.

6. Водяная баня.

7. Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

8. Предметные стекла по ГОСТ 9284.

9. Спектрофотометр.

10. Кюветы для фиксации и окраски гелей со штативом-контейнером.

11. Пипетка на 2 мл.

12. Унипипетка на 10 мкл и наконечники к ней.

13. Салфетка из бязи.

14. Хроматографическая бумага.

15. Пробирки Флоринского.

16. Штатив для пробирок.

17. Скальпель.

18. Стеклянная палочка.

19. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Материал для исследования.

Материалом для исследования служит сыворотка крови, свободная от гемолиза.

Ход определения.

1. Прежде чем приступить к работе, необходимо ознакомиться с инструкцией по эксплуатации прибора.

2. Предметные стекла, на которые наносят слой 1%-ного раствора агарового геля, должны быть чисто вымыты и обезжирены.

3. После застывания геля, на пластинках вырезают один резервуар. Вырезанный агаровый гель удаляют из лунки осторожно.

4. В универсальную разделительную камеру помещают веронал-мединаловый бу-фер рН=8,6 в количестве 5,5 литров.

5. На охлаждающуюся пластинку помещают предметные стекла в количестве 10 штук. На стекла с гелем кладут хроматографическую бумагу и замыкают цепь. В выре-занные лунки вносят по 10 мкл сыворотки крови.

6. Закрывают камеру крышкой и пропускают ток 4 мА на 1 стекло. Продолжитель-ность электрофореза 40 минут.

7. Затем стекла с гелем фиксируют в течение 1 часа.

8. После фиксации гелевые пластинки окрашивают в течение 1 часа раствором красителя.

9. После этого пластинки в течение 12 часов отмывают от избытка красителя 7%-ным раствором уксусной кислоты, несколько раз меняя раствор, до исчезновения фона.

10. Гелевые пластинки содержащие отдельные фракции, вырезают и помещают в пробирки, содержащие 4 мл 0,25 н раствор КОН для элюировавания.

11. Через 12 часов определяют оптическую плотность содержимого пробирок при =530 нм.

Расчет результатов.

При расчете результатов определяют сумму экстинкций всех фракций, принимая за 100%, и вычисляют долю каждой фракции.

ЗНАЧЕНИЕ. Исследование отдельных фракций белка имеет большое диагности-ческое значение, так как даёт возможность выявить патологию, при которой содержание общего белка сыворотки крови существенно не изменяется.

Уменьшение альбуминов при одновременном увеличении -глобулинов и -глобу-линов отмечают при гепатитах. Для цирроза характерно снижение альбуминов и резкое увеличение -глобулинов. Увеличение уровня альбуминов облегчает при обезвоживании. Снижение всех фракций - при массивной потере белка через кишечник (гастроэнтеропа-тии).

Изменение белковых фракций обусловливает диспротеинемию, выражением кото-рой является белковый коэффициент (отношение между количеством альбуминов и сум-мой глобулинов). В норме оно составляет 0,9-1,4.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021