ОЦЕНКА МЕЖПОРОДНОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЛОШАДЕЙ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ISSR-МАРКЕРОВ

Ю. Ф. КУРИЛЕНКО, И. А. СУПРУН Национальный университет биоресурсов и природопользования г. Киев, Героев Обороны 12б, к. 204, Украина, 03041

(Поступило в редакцию 27.01.2014)

Введение. Важным аспектом сохранения и создания разных сельскохозяйственных видов, в том числе лошадей, является мониторинг генетического полиморфизма популяций. Такой анализ осуществляют с помощью технологий ДНК, которые базируются на использовании разных типов маркеров ДНК.

Одним из вариантов изучения генетического полиморфизма популяций является амплификация межмикросателлитных фрагментов ДНК, расположенных между двумя инвертированными SSR-локусами генома, - ISSR - PCR [2, 4]. ISSR-типирова-ние основывается на использовании праймеров, комплементарных избранному микросател-литному мотиву [5, 9]. Сравнительно с другими методами мультило-кусного профилирования он характеризуется лучшей воспроизводимостью и эффективно используется для выявления внутривидовой и межвидовой генетической изменчивости, идентификации видов и популяций [10, 11].

Цель работы - провести оценку и анализ межпородного генетического полиморфизма лошадей при использовании ISSR-маркеров. Согласно данной цели было поставлено задание оценить эффективность применения ISSR-маркеров для анализа межпородной дифференциации лошадей и их пригодности для идентификации в коневодстве.

Материал и методика исследований. Для проведения исследований были отобраны образцы биологического материала у 112 представителей 5 популяций лошадей (арабская порода, новоолександровская тяжеловозная (Ягильницкий конный завод), орловская рысистая (КП «Киевский ипподром»), чистокровная верховая (Днепропетровский конный завод), лошади Пржевальского (биосферный заповедник «Ас-кания-Нова»). Геномную ДНК выделяли из крови и волосяных фолликулов лошадей с помощью комплекта реактивов «ДНК-сорб В» (Ам-плиСенс, Россия). В случае выделения ДНК из волосяных фолликулов продлевали время лизиса до 2 часов.

Концентрацию ДНК и степень ее чистоты определяли с помощью прибора NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Германия). Все пробы доводили до рабочей концентрации 20 нг/мкл.

Амплификацию проводили на амплификаторе «Терцик» (Россия) при таком температурном режиме: начальная денатурация - 4 мин при температуре 94 °С; 32 цикла: 30 с при 94 °С, 30 с при 58 °С, 2 мин при 72 °С; терминальная элонгация - 5 мин при 72 °С.

Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 67 мМ Tris - HCl (pH 8,8), 17 мМ (NH4) 2SO4, 0,01 % Tween - 20, 0,2 мМ дНТФ, 1,0 од. Tag-полимеразы, 40-80 нг ДНК, 1,5-1,8 мМ MgCl2 и 0,4-0,5 мкМ праймера. Оптимальную концентрацию каждого из компонентов реакции подбирали экспериментально.

Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в 1,5%-м агарозном геле при использовании 0,5 х ТВЕ-буфера при постоянном напряжении 100В в течение 80 минут. После окончания электрофореза гель обрабатывали бромистым этидием (0,5 мкг/мл), визуализировали под УФ-лучами и фотографировали цифровой камерой Panasonic DMC - FS42. Для определения молекулярной массы использовали маркер GeneRuler 100 bp («Fermentas», Литва). Исследование выполнено в лаборатории Института разведения и генетики животных НАНУ.

Результаты исследований и их обсуждение. Межпородную дифференциацию проводили между четырьмя породами лошадей (2 верховых, 1 рысистая, 1 тяжеловозная) и лошадьми Пржевальского при использовании двух ISSR -систем на основе праймеров (AGQ 6G (маркерная система S1) и (АСС) 6G (маркерная система S2).

Т а б л и ц а 1. Популяционно-генетическая характеристика лошадей разных популяций по маркерной системе ISSR - S1 на базе праймера (AGO) 6G

53

Количество выявленных локусов по данной маркерной системе варьирует от 16 у лошадей ваговозной породы, 50 % из которых оказались полиморфными, до 11 - у рысаков с уровнем полиморфизма 27,27 %. Наименее полиморфной популяцией среди исследованных оказались лошади Пржевальского: процент полиморфных локусов составляет 23,08, ожидаемая гетерозиготность - на уровне 0,046, индекс гетерогенности Шеннона - 0,069.

54

Рис. 1. Электрофоретические спектры ISSR-амплификации ДНК лошадей при использовании праймера (АСС) 6G: М - маркер молекулярных размеров (GeneRuler DNA Ladder Mix 100bp, Fermentas), 1-4 - арабская порода, 5-8 - лошади Пржевальского, 9-12 - орловская рысистая, 13-16 - новоолександровская тяжеловозная, 17-20 - чистокровная верховая порода

Для новоолександровской ваговозной породы был определен наивысший уровень гетерозиготности (0,152) и значения показателя генетического (И=0,221) соответственно. Данная порода является менее консолидированной сравнительно с другими исследованными популяциями, что может быть обусловлено меньшей интенсивностью искусственного отбора сравнительно с породами спортивного направления (верховыми и рысистыми).

Нумерация выявленных ампликонов проводилась от наиболее тяжелых по молекулярному весу к наиболее легким. Константными зонами амплификации по данной маркерной системе у всех животных независимо от породы являются локусы размером 1270, 970, 920, 670 и 420 п. н. (частота составила 1.000). Наряду с общими для исследованных пород ПЦР-продуктами в полилокусных спектрах фрагментов ДНК выявлены и породоспецифические особенности. Например, фрагменты размером 1070, 820, 760, 650, 620 и 530 п.н. были характерны только для лошадей новоолександровской тяжеловозной породы и встречались с частотами 0,375, 0,500, 0,500, 0,625, 0,750 и 1,000 соответственно. Наиболее длинный приватный аллель [1] размером 1400 п. н. выявлен только у орловских рысаков с частотой 0,625, тогда как для лошадей Пржевальского были характерны два приватных ал-леля размерами 1360 и 850 п. н. с частотой 0,625 и 0,125 соответственно. Три ПЦР-бэнда длиной 360, 900 и 1010 п. н. встречались во всех исследованных популяциях в большинстве животных с частотой выше средней. Два фрагмента размером 580 и 560 п. н. наблюдались во всех исследованных популяциях (1,000), кроме лошадей новоолександров-ской тяжеловозной породы. Ампликон размером 380 п. н. был отмечен у верховых пород и лошадей Пржевальского и вовсе не встречался у рысаков и тяжеловозов.

Таким образом, на основании анализа разных сочетаний вышеупомянутых фрагментов можно сделать вывод, что каждая порода имеет свой специфический ДНК-паттерн. Ю. А. Столповским [10] для определения породоспецифического паттерна у доместицированных видов было предложено использовать только фрагменты, которые встречаются с частотой 0,4 и выше. Для новоолександровской тяжеловозной породы выявлено 5 породоспецифических локусов и по 1 локусу для орловских рысаков и лошадей Пржевальского.

Популяционно-генетические показатели исследованных популяций лошадей при использовании маркерной системы S2 на основании мотива тринуклеотидного АСС указаны в табл. 2.

Т а б л и ц а 2. Популяционно-генетическая характеристика лошадей по маркерной системе ISSR - S2

55

При ISSR -типировании по маркерной системе S2 выявлены достоверно более высокие показатели генетической изменчивости у лошадей новоолександровской тяжеловозной породы (He=0,190, И=0,276, уровень полиморфизма 55 %). Значительно более высокий процент полиморфных локусов, сравнительно с S1, наблюдался в орловской рысистой породе. Популяция лошадей Пржевальского по данной маркерной системе оказалась наименее изменчивой в генетическом плане (ожидаемая гетерозиготность - на уровне 0,072, индекс Шеннона 0,109), что можно объяснить умеренным инбридингом и низкой эффективной численностью популяций, использованных в исследовании. Для других исследованных популяций показатели популяционно-генетической изменчивости варьировали незначительно (0,099-0,104 по гетерозиготности и 0,148-0,152 по индексу Шеннона).

Четыре ампликона размером 960, 900, 720 и 300 п.н. встречались у всех лошадей исследуемых пород и лошадей Пржевальского (1,000). Ампликоны размерами 1350, 1150 и 400 п.н. также были отмечены во всех популяциях с частотой выше средней и в то же время не наблюдались у рысаков.

По генетической системе ISSR-S2 у лошадей Пржевальского выявлен уникальный ДНК-фрагмент размером 850 п. н., так же, как ампли-кон, размером 1050 п. н., характерный только для представителей чистокровной верховой породы (0,250).

Достаточно уникальными в генетическом отношении оказались лошади новоолександровской тяжеловозной породы. Только изредка у них встречались аллели размером 800 и 370 п.н. (0,750 и 0,375 при их 100 % наличии у представителей других исследованных групп). Два фрагмента размером 670 и 320 п.н. встречались только у лошадей арабской и тяжеловозной пород. Три ПЦР-фрагмента длиной 1020, 680 и 500 п.н. с частотой выше средней или абсолютной встречались во всех исследованных популяциях у большинства животных. Наиболее тяжелый фрагмент спектра (1400) зарегистрирован во всех группах с частотой широкого диапазона: от 0,250 у лошадей Пржевальского до 1,000 у арабской породы. Локус размером 1190 п.н. встречался у верховых пород лошадей (арабская порода - 0,500, чистокровная верховая -0,125) и лошадей Пржевальского (1,000).

Фрагмент размером 1280 п.н. был синтезирован как у лошадей орловской рысистой породы (0,875), так и у особей чистокровной верховой (0,875), что можно объяснить их общей предковой формой - арабской породой (1,000), использованной на начальных этапах создания этих пород.

По системе ISSR - S2 выявлено меньшее общее количество приватных аллелей, в частности для животных новоолександровской тяжеловозной породы - 2 (1100 и 450 п.н. с частотами 0,250 и 0,500 соответственно), чистокровной верховой - 1 (1050 п.н., частота 0,250) и лошадей Пржевальского (850 п.н., имеющийся во всех). Таким образом, к породоспецифическим аллелям по данной маркерной системе для лошадей новоолександровской тяжеловозной породы можно отнести аллель длиной 450 п.н., поскольку у них он встречался с частотой выше 0,4.

Результат объединения данных по обеим маркерным системам представлен на рис. 2.

56

Рис. 2. Общее количество выявленных локусов и ожидаемая гетерозиготность (Не) по результатам ISSR -типирования по двум маркерным системам (S1+S2)

Для четырех исследованных популяций (кроме арабской породы) выявлены отдельные приватные аллели (рис. 1). Так, наличие фрагментов ДНК размером 820, 760, 650, 620 и 530 п. н., которые встречались с частотой соответственно 0,500, 0,500, 0,625, 0,750 и 1,000, полученных по маркерной системе S1 у лошадей новоолександровской тяжеловозной породы, можно использовать в качестве надежного критерия их идентификации, поскольку указанные ампликоны вовсе не встречаются в других исследуемых популяциях.

Для лошадей Пржевальского видоспецифичными оказались фрагменты размерами 1360 п.н. (при использовании маркерной системы S1) и 850 п.н. (S2) с частотами 0,625 и 1,000 соответственно.

Очевидно, что установленный фрагмент генетического локуса размером 1400 п. н., ограниченный микросателлитной последовательностью с коровым мотивом (тринуклеотидным AGC) 6G, использованным в качестве праймера, является уникальной последовательностью, характерной для лошадей орловской рысистой породы.

Заключение. Полученные результаты сравнения генетических структур пород лошадей и близкородственного дикого вида (лошади Пржевальского) свидетельствуют о том, что полилокусные спектры ISSR - PCR маркеров имеют выраженную породную специфичность. Их полиморфизм зависит от фрагмента микросателлитного локуса, используемого в качестве праймера, и позволяет выявить не только специфические особенности полиморфизма разных геномных участков, но и консервативные по длине фрагменты ДНК. Апробированные ISSR-маркерные системы выявили достаточный уровень полиморфизма для изучения внутривидовой изменчивости лошадей, которая может быть использована для выявления генофондных отличий у разных пород лошадей и, соответственно, для оценки вероятности породной принадлежности животных неизвестного происхождения.

ЛИТЕРАТУРА

1. A b e r l e, K. S. Genetic diversity in German draught horse breeds compared with a group of primitive, riding and wild horses by means of microsatellite DNA markers / K. S. Aberle, H. Hamann, C. Drogemiiller // Animal Genetics. - 2004. - V. 35. - P. 270-277.

2. B o r n e t, B. Highly informative nature of inter simple sequence repeat (ISSR) sequences amplified using triand tetra-nucleotide primers from DNA of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis L.) / B. Bornet, C. Muller, F. Paulus, M. Branchard // Genome. - 2002. -V. 45. - P. 890-896.

3. K u h l, D. P. A. Trinucleotide repeats and genome variation / D. P. A. Kuhl, C. T. Caskey // Curr Opin Genet. Dev. - 1993. - V. 3. - P. 404-407.

4. Z i e t k i e w i c z e, Е. Genome finger-printing by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain react^n amplification / Е. Zietkiewicze, A. Rafalski, D. Labuda // Genomics. - V.20. - 1994. - P. 176-183.

5. Б а р д у к о в, Н. В. Профили ДНК-маркеров (ISSR-PCR) у лошадей рысистых пород / Н. В. Бардуков, Г. К. Коновалова, В. И. Глазко // Изв. ТСХА. - 2010. - № 6. -С. 152 - 157.

6. Б е р е з о в с к а я, О. П. Внутри- и межвидовые различия в ISSR-PCR характеристике шмелей (HYMENOPTERA: BOMBINAE) / О. П. Березовская, О. Ю. Мороз, А. П. Сидоренко // Цитология и генетика. - 2002. - T. 36. - № 3. - С. 28-35.

7. В о р о н к о в а, В. Н. Сравнительный анализ информативности ISSR-маркеров для оценки генетического разнообразия пород лошадей / В. Н. Воронкова, Цэндсурэн Цэдэв, Г. Е. Сулимова // Генетика. - 2011. - Т. 47 - № 8. - С. 1131-1134.

8. Г л а з к о, В. И. Введение в ДНК технологии и биоинформатику / В. И. Глазко, Г. В. Глазко; под ред. Т. Т. Глазко. - К., 2001. - 544c.

9. Метлицька О. I. Методолопя ДНК-паспортизаци генофощцв сшьськогоспо-дарських тварин за гшервар1абельними локусами геному: дис. на здобуття наук. ступеня доктора с.-г. наук: 03.00.15 / Метлицька Олена 1вашвна. - Полтава, 2012. - 382 с.

10. Применение межмикросателлитного анализа ДНК для оценки популяционной структуры, идентификации и сходства генофондов пород и видов доместицированных животных / Ю. А. Столповский, О. Е. Лазебный, К. Ю. Столповский [и др.] // Генетика. -2010. - Т.46 - № 6. - С. 825-833.

11. Ф е о ф и л о в, А. В. Дифференциация генофондов алтайской и рысистых пород лошадей по ISSR-PCR маркерам / А. В. Феофилов, Н. В. Бардуков, В. И. Глазко // Генетика. - 2011. - Т. 47 - № 9. - С. 1230-1235.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021