ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ОСНОВЕ ДНК-АНАЛИЗА

А. И. ГАНДЖА, О. П. КУРАК, Л. Л. ЛЕТКЕВИЧ, В. П. СИМОНЕНКО, И. В. КИРИЛЛОВА, Н. В. ЖУРИНА, М. А. КОВАЛЬЧУК РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству» г. Жодино, Минская обл., Республика Беларусь, 222160

(Поступило в редакцию 23.01.2014)

Введение. Важной задачей современной биотехнологии в области животноводства является получение животных желательных генотипов, рассматривающееся в качестве инструмента для последовательного улучшения генофонда разводимых пород крупного рогатого скота. В решении этого вопроса значительную и всевозрастающую роль играют новые молекулярно-генетические методы исследований, которые могут принципиально изменить подходы к раннему прогнозированию продуктивных качеств животных и диагностике наследственных заболеваний.

К настоящему времени появилась возможность разработки подходов к оценке генотипа эмбрионов животных по ряду генетических маркеров методами ДНК-анализа, что является одним из резервов повышения эффективности селекционной работы. Экстракорпоральное оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота, созревших in vitro, в сочетании с разрабатываемой технологией генотипирования получаемых эмбрионов методом ПЦР позволит в ближайшей перспективе существенно активизировать селекционный процесс. Это будет способствовать решению ряда задач по углубленной генотипической оценке животных, позволяющей проводить трансплантацию эмбрионов с генетическими вариантами, представляющими наибольший интерес для племенной работы. Разработка методологии генотипирования эмбрионов крупного рогатого скота на основе ДНК-анализа даст реальную возможность для увеличения частоты предпочтительных аллелей в популяциях КРС за короткое время, сохранения и рационального использования их генофонда, конструирования желательных генотипов и их массового воспроизводства.

Вторым перспективным направлением генетических исследований на клеточном уровне является разработка методов прижизненного определения пола эмбрионов крупного рогатого скота. Решение проблемы регуляции пола в потомстве сельскохозяйственных животных имеет не только научно-теоретическое, но и практическое значение как для товарного, так и для племенного животноводства.

Исследования, направленные на разработку методов генотипирова-ния сельскохозяйственных животных на ранней стадии эмбриогенеза, с одновременным сохранением жизнеспособности биопсируемых эмбрионов, перспективны для расширения всего спектра биотехнологических исследований в животноводстве, которые преследуют основную цель - получение особей желательного генотипа [1, 2, 6, 7]. Значительные перспективы открывает их применение в программах по трансгене-зу. Многие зарубежные исследователи считают, что достижение передовых позиций в области биотехнологии является одной из приоритетных задач экономической политики любого государства [3-5, 8, 9].

Создание и внедрение в селекционный процесс ДНК-анализа для генотипирования эмбрионов крупного рогатого скота является актуальной проблемой, решение которой позволит проводить селекционный процесс более интенсивно и на высоком генетическом уровне.

Цель работы - разработать методику генотипирования эмбрионов КРС на основе ДНК-анализа.

Материал и методика исследований. Исследования проведены в лаборатории молекулярной биотехнологии и ДНК-тестирования РУП «НПЦ НАН Беларуси по животноводству».

В качестве доноров использовались клинически здоровые высокопродуктивные коровы белорусской черно-пестрой породы (с продуктивностью на уровне 6-8 тыс. кг молока), с известным происхождением, независимо от фазы полового цикла и возраста. Предмет исследований - эмбрионы крупного рогатого скота, полученные in vitro.

Для исследований отбирались яичники без видимых признаков патологии, находящиеся на стадии фолликулярного роста или рассасывающегося желтого тела.

Извлечение ооцитов проводили путем рассечения ткани яичников лезвием безопасной бритвы в растворе Хенкса в чашке Петри с добавлением 10 ед./мл гентамицина, 1 ед./мл гепарина и 1 % инактивиро-ванной фетальной сыворотки. Морфологическую оценку качества полученных ооцит-кумулюсных комплексов осуществляли по разработанной 5-балльной шкале под бинокулярным микроскопом МБС-10 при 16- и 56-кратном увеличении.

Для дальнейшей работы отбирали клетки с многослойным компактным или слегка разрыхленным кумулюсом, плотно прилегающим к зоне пеллюцида, мелкозернистой или имеющей небольшие участки гранулярной конденсации ооплазмой, равномерно заполняющей прозрачную оболочку, которая равномерна по толщине, не имеет никаких дефектов, округлая по форме.

Ооцит-кумулюсные комплексы помещали в лунки планшета со средой для созревания на основе ТС-199 (Sigma) в СО2-инкубатор на 24 часа. Созревшие ооциты оплодотворяли замороженно-оттаянной спермой. Далее оплодотворенные фолликулярные ооциты отмывались средой для культивирования зародышей и переносились в чашках Петри с лунками в СО2-инкубатор при температуре 38 °С, максимальной влажности и содержании в атмосфере 5 % СО2. Для культивирования зародышей была использована питательная среда ТС-199.

Результативность культивирования эмбрионов, полученных после оплодотворения фолликулярных ооцитов вне организма, определялась по количеству дробящихся клеток и выходу преимплантационных зародышей. После окончания процесса оплодотворения клетки переносили в среду для культивирования ранних зародышей.

Процедура биопсии на стадии преимплатанционных эмбрионов проводилась с использованием микроскопа «Axiovert 25» и микроманипуляторов «Narishige» в чашке Петри или на предметном стекле в зависимости от метода деления.

Все эксперименты, связанные с извлечением ооцитов, их оценкой, культивированием и оплодотворением, а также созреванием ранних зародышей проводились в условиях строгой стерильности в специальном боксе с использованием ламинарного шкафа.

Выделение ДНК из эмбрионов проводили с использованием лизи-рующего раствора, а также методом температурного шока.

В экспериментах в качестве матрицы ДНК использовались целые эмбрионы крупного рогатого скота, полученные in vitro, оцененные как «хорошие» или «отличные», на различных стадиях развития: от 48 бластомеров до морулы-бластоцисты.

Результаты исследований и их обсуждение. В ходе научно-производственных исследований были разработаны параметры выделения ДНК из эмбрионов на разных стадиях развития методом «температурного шока» и с использованием лизирующего раствора. Для получения геномной ДНК использовались две методики выделения.

В первом случае промытые от остатков соматических клеток куму-люса и минерального масла в среде для культивирования на основе ТС-199 эмбрионы, полуэмбрионы или бластомеры помещали индивидуально в центрифужные пробирки с 50 мкл бидистиллированной воды для последующего изолирования методом «температурного шока». С этой целью пробирки выдерживали 3 мин. при 100 °C, затем - 3 мин. при 55 °C и еще 2 раза при 100 °C и при 55 °C. Далее пробирки с содержимым охлаждали до комнатной температуры, центрифугировали при 1000 об/мин - 1 мин. и охлаждали до 4 °C. Для проведения ПЦР брали 1 мкл надосадочной жидкости.

Во втором случае биоптат в 0,1 мкл среды и 0,1 среды в качестве отрицательного контроля переносится в реакционные пробирки, содержащие 3 мкл дистиллированной воды. Затем пробирки помещаются на 2-3 секунды в жидкий азот, оттаиваются до комнатной температуры, инкубируются при 99 °C в течение 5 мин и охлаждаются до 30 °C. После этого к содержимому добавляется реакционная смесь.

Использование целых эмбрионов на начальной стадии исследований было обусловлено необходимостью выработки принципиальных подходов к разработке оптимальных параметров выделения ДНК. Дальнейшее использование данных эмбрионов не предполагалось, что дало возможность для многократного биопсирования каждого эмбриона с целью оптимизации техники микроманипуляций.

Для выделения ДНК с использованием лизирующего раствора био-птат (промытые от остатков соматических клеток кумулюса и минерального масла в среде для культивирования эмбрионы, полуэмбрионы или бластомеры) помещали индивидуально в микроцентрифужные пробирки, содержащие 50 мкл лизирующего буфера. Состав буфера: 15 мМ Tris HCl, pH 8,9, 50 mM KCl, 0,1 % Tritonx100, 150 мг/мл про-теиназы К.

В серии опытов были подобраны условия оптимального образования ПЦР-продукта при использовании в качестве матрицы ДНК различных вариантов: целых эмбрионов, полуэмбрионов (на стадии 816 клеток), а также 4-8 бластомеров, а также оценена эффективность прохождения реакции при комбинировании различных методов выделения и количества используемых клеток.

Подбор условий для эффективного образования ПЦР-продукта включал в себя: подбор специфических олигонуклеотидных праймеров; оценку стабильности буферной системы; оптимизацию процесса амплификации по температурному и временному профилю реакции и режима визуализации; использование адекватных позитивного и негативного контролей. В качестве положительного контроля во всех опытах была использована ДНК, выделенная из спермы или ткани, а в качестве отрицательного - дистиллированная вода. Использование отрицательного контроля позволяло оценить вероятность присутствия случайных источников ДНК в случае контаминации амплификационной смеси.

Для отработки оптимальных условий образования ПЦР-продукта были взяты специфические праймеры для генотипирования эмбрионов по локусу гена каппа-казеина. Наличие фрагмента длиной 530 п.о. свидетельствовало об успешном завершении амлификации (рис. 1).

Полученный ПЦР-продукт подвергался рестрикции с использованием эндонуклеазы HindIII.

23

Рис. 1. Полученный амплификат

При использовании в качестве матрицы ДНК целых эмбрионов, полученных методом «температурного шока», были получены следующие результаты: одна реакция - 92,8 %, две независимые реакции -94,0 %, три независимые реакции - 96,4 % (табл. 1).

Т а б л и ц а 1. Эффективность ПЦР при использовании в качестве матрицы ДНК, выделенной из эмбрионов на разных стадиях развития методом «температурного шока»

24

При использовании в анализе полуэмбрионов (на стадии 8-16 клеток) полученные результаты были несколько ниже: одна реакция - 72,2 %, две независимые реакции - 92,0 %, три независимые реакции - 94,8 %.

Были поставлены пробные реакции с единичными бластомерами. При анализе посредством одной реакции положительные результаты были получены в 68,4 %. При проведении двух независимых реакций положительный результат получен в 71,0 %, а при выполнении трех независимых реакций - в 87,6 % случаев.

Таким образом, максимальное количество положительных результатов было получено при использовании целых эмбрионов. Дальнейшие исследования будут направлены на увеличение процентного выхода пригодных для дальнейшего анализа образцов, полученных с использованием единичных бластомеров.

При использовании второй методики выделения ДНК (в азоте) были получены неоднозначные результаты, требующие выполнения серии дополнительных опытов.

Во второй серии опытов для постановки ПЦР использовали в качестве матрицы ДНК, полученные с помощью лизирующего раствора. Смесь подвергали инкубации в течение 30-60 мин при температуре 37 °C. Денатурацию протеиназы К осуществляли в течение 8 мин при температуре 99 °C.

По результатам генотипирования 20 целых эмбрионов установлено, что положительные результаты были получены в 74,2 % случаев (табл. 2).

При использовании в анализе полуэмбрионов (на стадии 8-16 клеток) процент успешно завершенной амплификации составил в 62,5 %, нескольких бластомеров - лишь 47,8 %.

Т а б л и ц а 2. Эффективность ПЦР при использовании в качестве матрицы ДНК, выделенной из эмбрионов на разных стадиях развития с использованием лизирующего раствора

25

Полученные результаты свидетельствуют о возможности практического использования метода выделения ДНК из эмбрионов на разных стадиях развития с использованием лизирующего раствора для проведения дальнейшего генотипирования по локусам хозяйственно-значимых признаков эмбрионов крупного рогатого скота.

В результате сравнительных исследований установлено, что наиболее приемлемым следует считать быстрый (до 15 мин) лизис биоптата методом «температурного шока». На эффективность амплификации использование данного метода выделения не оказывает существенного влияния, что подтверждается отсутствием необходимости тщательной депротеинизации ДНК. При этом значительно экономится время, исключаются потери ДНК, а также дополнительные источники контаминации, обуславливающие ошибки при генотипировании и снижается стоимость работы за счет исключения дорогостоящей протеиназы К и других реагентов.

Чувствительность метода ПЦР такова, что позволяет проводить амплификацию ДНК даже на материале одной клетки. В наших экспериментах при модельной оптимизации метода ПЦР амплификация проходила при использовании нескольких бластомеров эмбрионов, тем не менее для достижения достаточной эффективности генотипиро-вания следует использовать в качестве матрицы не менее 10 % эмбриональной массы, что, с одной стороны, незначительно снижает жизнеспособность биопсируемых эмбрионов, а с другой - позволяет получить положительные результаты. Использование меньшего количества клеток лучше для сохранения жизнеспособности эмбриона, в отличие от крупной биопсии, однако малое количество ДНК-материала, получаемое при этом, ограничивает возможности амплификации.

Выявлено, что с увеличением сроков хранения эмбрионов (до двух недель) снижается количество получаемых положительных результатов (до 18-22 %).

Большое значение имеет метод получения биоптатов. В отличие от довольно травматичного разрезания эмбриона микроножом биопсия с помощью специальной микропипетки с заточенным концом позволяет с минимальными повреждениями извлекать необходимое количество эмбрионального материала и, кроме того, исключает контаминацию биоптата.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о принципиальной возможности оценки генотипа преимплантационных эмбрионов крупного рогатого скота на материале 4-8 бластомеров, что делает приемлемым применение данного метода для проведения процедуры отбора эмбрионов и использования их с максимальной эффективностью. Кроме того, значительное сокращение временных затрат вследствие модификации и оптимизации режимов выделения и анализа ДНК позволит завершить весь технологический процесс по получению, генотипированию и пересадке эмбрионов реципиентам в течение одних суток. Этот вопрос является актуальным для обеспечения высокого уровня имплантируемости эмбрионов.

Выявлено, что эффективность генотипирования в значительной степени определяется условиями проведения ПЦР, которые предварительно были адаптированы на матрице геномной ДНК коров и быков с установленными генотипами по локусам генов каппа-казеина. Так, оптимизация температуры отжига праймеров и введение «горячего старта» для повышения качества ПЦР-продукта позволяют в значительной степени снизить вероятность неспецифической амплификации. Данный аспект актуален при продолжительной реакции амплификации, которая может быть доведена до 35-45 циклов. В этом случае на матрице отдельного биоптата эмбриона генерируется достаточное для последующего рестриктного анализа количество ПЦР-продукта.

При выполнении работы температурный и временной профили реакции были отрегулированы таким образом, чтобы при амплификации желаемого локуса не наблюдалось побочных продуктов при проведении генотипирования эмбрионов КРС.

В ходе исследований была разработана методика генотипирования эмбрионов КРС на основе ДНК-анализа, включающая: варианты использования эмбрионов на разных стадиях развития; получение био-птатов с сохранением жизнеспособности биопсируемых эмбрионов; параметры выделения ДНК из эмбрионов на разных стадиях развития методом «температурного шока» и с использованием лизирующего раствора; условия эффективного образования ПЦР-продукта на основе изучения термодинамических параметров реакции для генотипирова-ния эмбрионов КРС.

Полученные результаты являются базой для дальнейших исследований, направленных на разработку и внедрение методов преимплан-тационной диагностики по локусам, связанным с продуктивными качествами, генам, детерминирующим развитие наследственных заболеваний, определения пола и последующей трансплантацией эмбрионов с желательными генотипами

Заключение. Результаты исследований позволяют сделать вывод о возможности практического использования метода генотипирования эмбрионов крупного рогатого скота на разных стадиях развития по ло-кусам хозяйственно значимых признаков.

Разработанные параметры выделения ДНК из целых эмбрионов, полуэмбрионов и единичных бластомеров и подобранные условия эффективного образования ПЦР-продукта на основе изучения термодинамических параметров реакции позволяют получить до 92,8 % образцов, пригодных для дальнейшего проведения ДНК-анализа

Полученные результаты являются базой для дальнейших исследований, направленных на разработку и внедрение методов преимплан-тационной диагностики крупного рогатого скота с целью генотипиро-вания эмбрионов по локусам хозяйственно значимых признаков, наследственных заболеваний и определения пола, с одновременным сохранением жизнеспособности биопсируемых эмбрионов, а также проведения маркер-зависимой селекции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Сучасний стан та перспективи генетично-селекцшного i бютехнолопчного мониторингу в тваринництвi Украши / М. В. Зубець [та шш.] // Вiсн. Сумського нац. аграр. ун-ту. - 2002. - Вип.6. - С. 3-12.

2. Э р н с т, Л. К. Итогии перспективы исследования по биотехнологии животных / Л. К. Эрнст // Зоотехния. - 1999. - № 8. - С. 23-25.

3. S t r o m, C. M. DNA analysis of polar bodies and preembryos / C. M. Strom, S. Re-chitsky // Preimplantation diagnostics of genetic diseases. A new technigue in assiated reproduction. - Willey-Liss, 1993. - Vol. 77. - P. 69-91.

4. Genetic progress in multistage dairy cattle breeding schemes using genetic markers / C. Schroten [et al.] // J. Dairy Sci. - 2005. - Vol. 88. - P. 1569-1581.

5. H e r r, C. M. Micromanipulation of bovine embryos for sex determination / C. M. Herr, K. C. Reed // Theriogenology. - 1991. - Vol. 35. - P. 45-54.

6. К о в т у н, С. И. Генетические исследования раннего эмбриогенеза в условиях in vitro для племенного животноводства / С. И. Ковтун, П. А. Троицкий, М. Г. Порхун // Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве с.-х. животных: материалы между-нар. науч. конф. / ВНИИГРЖ. - Санкт-Петербург, 2009. - С. 115-118.

7. Генотипирование эмбрионов крупного рогатого скота по типам к-казеина методом полимеразной цепной реакции / С. Ю. Медведев [и др.] // Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных: сб. науч. тр. - СПб., 1999. - С. 247-252. - Соавт.: Н. П. Босак, Л. Д. Галиева, Г. А. Шагиахметова, Г. П. Косякова, В. Н. Горячев, А. Ф. Яковлев.

8. S p e l m a n, R. Effect of inaccurate parameter estimates on genetic response to marker assisted selection in an out bred population / R. Spelman, J. A. van Arendok // J. Dairy Sci. -1997. - Vol. 80. - P. 3399-3410.

9. Expression of male-specific factor on various stages of preimplantation bovine embryos / White [et al.] // Biol. Reprod. - 1987. - Vol. 37. - P. 867-873.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021