4.4.9. Определение белковых фракций в сыворотке крови

Принцип метода. Компоненты белковой смеси мигрируют в элек-трическом поле (в геле агарозы или агара) в направлении и со скоростью, зависящей от заряда их молекул и влияния электроэндоосмоса. В резуль-тате смесь делится на фракции, которые можно выявить и измерить коли-чественно.

Реактивы. 1. Веронал-мединаловый буфер рН=8,6 (9,3 г веронала и 51,5 г мединала растворяют в 2 л дистиллированной воды, через сутки буферный раствор профильтровать и развести в 2 раза). 2. 1%-ный рас-твор агарового геля (1 г агара растворяют в 100 мл веронал-мединалового буфера рН=8,6 и выдерживают на кипящей водяной бане 2 часа, затем охлаждают гель до 50°С и выдерживают в термостате 1 час при темпера-туре 50°С, для выравнивания температуры геля). 3. 20% раствор уксусной кислоты (400 г ледяной уксусной кислоты растворяют в 2 л дистиллиро-ванной воды). 4. Фиксирующий раствор (300 мл этилового спирта и 100 мл 20%-ного раствора уксусной кислоты). 5. Раствор для окраски гелей (1 г бромфенолового синего, 500 мл этилового спирта, 100 мл ледяной ук-сусной кислоты и 400 мл дистиллированной воды). 6. 7% раствор уксус-ной кислоты (140 г ледяной уксусной кислоты растворяют в 2 л дистилли-рованной воды). 7. 0,25 н раствор КОН.

Оборудование и аппаратура. 1. Прибор для электрофореза. 2. Ис-точник постоянного тока. 3. Дозатор по ГОСТ 1770. 4. Весы аналитиче-ские по ГОСТ 24104-2001. 5. Термостат. 6. Водяная баня. 7. Холодильник бытовой по ГОСТ 16317. 8. Предметные стекла по ГОСТ 9284. 9. Спек-трофотометр. 10. Кюветы для фиксации и окраски гелей со штативом-контейнером. 11. Пипетка на 2 мл. 12. Унипипетка на 10 мкл и наконечни-ки к ней. 13. Хроматографическая бумага. 14. Пробирки Флоринского. 15. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Материал для исследования. Материалом для исследования служит сыворотка крови, без следов гемолиза.

Ход определения. Прежде чем приступить к работе, необходимо ознакомиться с инструкцией по эксплуатации прибора. Предметные стек-ла, на которые наносят слой 1%-ного раствора агарового геля, должны быть чисто вымыты и обезжирены. После застывания геля на пластинках вырезают один резервуар. Вырезанный агаровый гель удаляют из лунки осторожно.

В универсальную разделительную камеру помещают веронал-медина-ловый буфер рН=8,6 в количестве 5,5 литров. На охлаждающуюся пластинку помещают предметные стекла в количестве 10 штук. На стекла с гелем кладут хроматографическую бумагу и замыкают цепь. В вырезан-ные лунки вносят по 10 мкл сыворотки крови. Закрывают камеру крыш-кой и пропускают ток 4 мА на 1 стекло. Продолжительность электрофоре-за 40 минут.

Стекла с гелем фиксируют в течение 1 часа. После фиксации гелевые пластинки окрашивают в течение 1 часа раствором красителя. После этого пластинки в течение 12 часов отмывают от избытка красителя 7%-ным рас-твором уксусной кислоты, несколько раз меняя раствор, до исчезновения фона.

Гелевые пластинки, содержащие отдельные фракции, вырезают и помещают в пробирки, содержащие 4 мл 0,25 н раствор КОН для элюиро-вавания. Через 12 часов определяют оптическую плотность содержимого пробирок при =530 нм.

Расчет результатов. При расчете результатов определяют сумму экстинкций всех фракций, принимая за 100%, и вычисляют долю каждой фракции.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021