4.4.7. Определение метаболической (функциональной) активности нейтрофилов (НСТ-тест)

Принцип НСТ-теста состоит в образовании нерастворимых окрашен-ных гранул формазана при восстановлении нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидным анион-радикалом, образующимся при активации фагоци-тов. Этот тест отражает степень активизации кислородозависимых меха-низмов бактерицидной активности фагоцитирующих клеток, в основе ко-торых лежит активация НАДФ-H2-оксидазы и гексозомонофосфатного шунта. Электроны, освобожденные с НАДФ-Н2, превращают молекуляр-ный кислород в супер-оксиданион О2•, восстанавливающий нитросиний тетразолий.

Различают спонтанный НСТ-тест с интактными полиморфноядерными лейкоцитами, не подвергавшимися воздействию стимуляторов, и индуци-рованный, например, воздействием инактивированной прогреванием сус-пензии стафилококка или частиц латекса.

Реактивы. 1. 0,2% раствор НСТ в изотоническом растворе натрия хлорида.

2. 0,15 М фосфатный буфер (рН 7,2).

Раствор НСТ в фосфатном буфере готовят непосредственно перед опытом путем смешивания равных количеств 0,2% раствора НСТ и 0,15 М фосфатного буфера.

Ход определения. К 50 мкл стабилизированной гепарином крови до-бавляют 20 мкл фосфатного буфера, 20 мкл раствора НСТ (окрашенная тест-система), которая состоит из взвеси латекса (50000 частиц/мкл) и 0,1%-ного нитросинего тетразолия. Пробирки встряхивают и ставят на 30 мин. в термостат при 37°С. Затем делают мазки, которые фиксируют в ме-таноле в течение 10 мин., промывают водой, высушивают и красят метиле-новым зеленым 10 мин. и снова промывают водой.

Учет результатов. Под микроскопом, пользуясь иммерсионной си-стемой, проводят подсчет 200 нейтрофилов и определяют процент поло-жительно реагирующих с НСТ, отмечается выпадение гранул формазана фиолетово-синего цвета. В цитоплазме отрицательно реагирующих с НСТ клеток гранулы формазана отсутствуют. При оценке результатов НСТ-теста подсчитывают процент клеток, содержащих гранулы формазана от общего их количества.

По степени активности реакции все клетки разделяют на 4 группы:

0 гр. - нейтрофилы без гранул.

1 гр. - нейтрофилы, у которых гранулы формазана занимают 1/4-1/3 цитоплазмы (1 степень активности).

2 гр. – нейтрофилы, у которых вся цитоплазма заполнена гранулами формазана, но имеются участки разряженности (2 степень активности).

3 гр. – нейтрофилы, у которых цитоплазма полностью заполнена гра-нулами формазана (3 степень активности).

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021