4.4.3. Определение содержания пропердина в сыворотке крови

Принцип метода. Метод основан на свойстве пропердина при темпе-ратуре 15°С образовывать комплекс с зимозаном, который при темпера-туре 37°С инактивирует гемолитическую активность комплемента сыво-ротки крови морской свинки. Концентрацию пропердина определяют по разнице гемолитической активности нативного и имевшего контакт с испы-туемой сывороткой и зимозаном комплемента морской свинки.

Реактивы. 1. Веронал-мединаловый буфер (ВБ), рН 7,4. Перед при-менением его разводят дистиллированной водой в соотношении 1:4.

2. 0,1 %-ный раствор Nа2СО3. Готовят непосредственно перед исполь-зованием.

3. Рабочая взвесь зимозана. Зимозан тщательно растирают в фарфо-ровой ступке, заливают физиологическим раствором натрия хлорида из расчета 200 мл на 100 мг зимозана и кипятят в водяной бане в течение 1 часа. Охлажденную до комнатной температуры взвесь центрифугируют 15 мин. при 3 тыс. об/мин, осадок отмывают 2 раза физиологическим раство-ром и суспендируют в рабочем растворе веронал-мединалового буфера (ВБ) до конечной концентрации зимозана 5 мг/мл. Приготовленную взвесь зимозана можно хранить при 4°С до 7 дней. Перед применением ее два-жды отмывают физраствором и вновь доводят концентрацию рабочим раствором ВБ до 5 мг/мл.

4. Реактив на пропердин (РП). Готовят путем абсорбции зимозаном пропердина из сыворотки крови морской свинки, которая используется в качестве источника комплемента. Делается это для того, чтобы содержа-щийся в сыворотке пропердин не влиял на результаты опытов. Сыворотку крови морской свинки помещают в охлажденный до 2-4°С центрифужный стакан, добавляют к ней зимозан из расчета 5 мг сухого вещества (1мл ра-бочей взвеси) на 10 мл объема и инкубируют 1 ч в водяной бане при тем-пературе 15°С. Полученную смесь через каждые 20 мин. перемешивают.

По окончании инкубирования смесь зимозана и сыворотки центрифу-гируют, сливают надосадочную жидкость в другой охлажденный центри-фужный стакан и повторяют с ней эту же операцию еще раз. В результате получают сыворотку, содержащую комплемент, но лишенную проперди-на.

Общепринятым методом по 100%-ному лизису 0,25%-ной взвеси сен-сибилизированных кроличьим гемолизином эритроцитов барана опреде-ляют гемолитическую активность полученного комплемента. Для опреде-ления пропердина используют реактив с активностью комплемента 160 ед/мл. Реактив можно хранить в замороженном виде при температуре ми-нус 25-38°С. Перед использованием его размораживают и определяют ге-молитическую активность.

5. Гемолитическая система. Готовят ее следующим образом:

А) эритроциты барана отмывают 2-3 раза 3-10-кратными объемами физраствора натрия хлорида центрифугированием при 3 тыс. об/мин. От-мытый осадок разводят до 5%-ной концентрации веронал-мединаловым буфером в рабочем разведении. Конечная концентрация взвеси эритроци-тов соответствует 0,6 ед. оптической плотности. Для определения оптиче-ской плотности 0,5 мл взвеси лизируют в 7 мл 0,1%-ного раствора Nа2СО3 и измеряют плотность лизата на ФЭК-56 в кюветах с рабочей длиной 10 мм при зеленом светофильтре (№8) против дистиллированной воды.

Б) полученную 5%-ную взвесь эритроцитов барана разводят веронал-мединаловым буфером в рабочем разведении до 0,5%-ной концентрации. С этой целью 1ч взвеси эритроцитов смешивают с 9 ч буфера.

В) к приготовленной 0,5%-ной взвеси эритроцитов барана добавляют равный объем разведенной кроличьей гемолитической сыворотки. Гемо-литическую сыворотку разводят веронал-мединаловым буфером в рабо-чем разведении до концентрации, которая в 4 раза превышает ее предель-ный титр.

Гемолитическую систему (сенсибилизированные эритроциты) исполь-зуют только в день приготовления, хранению они не подлежат.

Ход определения. 1. В опытную пробирку вносят 0,05 мл испытуемой сыворотки, 0,25 мл реактива на пропердин и 0,2 мл рабочей взвеси зимо-зана.

2. В первую контрольную пробирку вносят 0,05 мл испытуемой сы-воротки и 0,45 мл веронал-мединалового буфера.

3. Во вторую контрольную пробирку помещают 0,25 мл реактива на пропердин, 0,1 мл рабочей взвеси зимозана и 0,15 мл веронал-мединалового буфера. Этот контроль можно ставить один на две пробы. Контроли исключают антипропердиновое действие буфера и антикомпле-ментарное действие зимозана.

4. Все пробирки встряхивают и помещают в термостат или водяную баню при температуре 37°С на 1 ч. Через каждые 15-20 мин. инкубирова-ния их снова встряхивают.

5. После инкубирования опытную и вторую контрольную пробирки центрифугируют при 3 тыс. об./мин. в течение 15 мин. Не взмучивая осад-ка, удаляют надосадочную жидкость и сливают в соответственно помечен-ные чистые пробирки, которые затем хранят на холоде (0-4°С). На втором этапе определяют, на сколько снизилась гемолитическая активность ком-племента в опытной пробирке по сравнению с контролем.

6. Из опытной пробирки берут 0,3 мл надосадочной жидкости и раз-водят ее веронал-мединаловым буфером так, чтобы получить разведения 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50. Во всех пробирках остав-ляют по 0,5 мл жидкости.

7. Из первой и второй контрольных пробирок отбирают по 0,15 мл надосадочной жидкости, смешивают, а затем разводят так же, как жид-кость из опытной пробирки. Смешивание содержимого обеих контроль-ных пробирок позволяет выявить антикомплементарные свойства испыту-емой сыворотки крови. Поскольку в начале опыта комплемент вносили только во вторую контрольную пробирку, разведение комплементсодер-жащей жидкости в контроле будет в 2 раза выше, чем в опытном ряду. Оно будет соответственно равняться 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 и 1:100. В пробирках с каждым указанным разведением оставляют по 0,5 мл жидкости.

8. Во все пробирки опытного и контрольного ряда вносят по 1 мл ге-молитической системы и помещают их в термостат или водяную баню при температуре 37°С на 30 мин. Через каждые 10 мин. пробирки необходимо встряхивать.

9. Визуально определяют в каком разведении в опытном ряду отмеча-ется полная задержка (отсутствие) гемолиза и в каком разведении в кон-трольном ряду отмечается полный гемолиз.

Расчет. Данные рассчитывают по формуле:

20

где

Г100%К - разведение, в котором отмечен полный гемолиз в контроле;

Г0%О - разведение, в котором отмечена полная задержка гемолиза в опыте.

Полученный результат выражают в ед./мл.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021