4.4.2. Определение активности комплемента сыворотки крови

Принцип метода: определение комплементарной активности сыво-ротки крови основано на способности комплемента в присутствии гемоли-тической сыворотки вызывать лизис эритроцитов барана.

Реактивы: 1. Основной (концентрированный) буфер (веронал – 2,875 г, мединал – 1,8475 г, натрия хлорид – 42,5 г, вода бидистиллированная до 1 л, рН буфера 7,3 - 7,4).

2. Рабочий раствор. Готовят из основного буфера (1 ч. концентриро-ванного буфера + 4 ч. бидистиллированной воды смешивают в мерной колбе). Срок хранения раствора 24 ч.

3. Кровь барана.

4. В день работы получают эритроциты барана и отмывают рабочим раствором до получения прозрачной надосадочной жидкости. Центрифу-гирование эритроцитов проводят при 3000 об/мин, в течение 10 мин., обычно 3 раза. Надосадочную жидкость каждый раз удаляют пипеткой. Для получения 2,5%-й взвеси эритроцитов в зависимости от количества опытных пробирок подбирают объем эритроцитов и количество буфера с учетом контрольных проб.

5. Разведение гемолитической сыворотки. Используют производ-ственные серии гемолитической сыворотки, ее титр указан на этикетке и проверяется перед работой (К1). Для реакции гемолиза гемолитическую сыворотку берут в 4-х-кратном разведении. Объем, в котором разводится гемолитическая сыворотка (мл), равен объему эритроцитарной взвеси.

Ход определения. В центрифужные пробирки разливают по 3 мл ра-бочего раствора и по 0,3 мл сыворотки. Кончик пипетки с сывороткой пе-ред внесением в буфер тщательно вытирают, а после внесения промывают буфером в пробирке не менее 2-х раз.

Опыт сопровождается постановкой 2-х контролей: К1 (контроль гемо-литической системы) – в пробирку наливают 3 мл рабочего буфера, К2 (контроль 100%-го гемолиза) – в пробирку наливают 3 мл бидистиллиро-ванной воды.

Опытные пробирки, контрольные (К1 и К2), эритроцитарную взвесь и гемолитическую сыворотку (разведенную) помещают в термостат на 30 мин. при температуре 37°С. По истечении указанного срока гемолитиче-скую сыворотку быстро смешивают с эритроцитарной взвесью в равных объемах. Полученную гемолитическую систему разливают во все пробир-ки, включая К1 и К2 по 2 мл. Содержимое осторожно перемешивают и сно-ва помещают в термостат на 30 мин при температуре 37ºС (через 15 мин. нужно повторно перемешать). После этого пробы центрифугируют (кроме К2) при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость колори-метрируют на ФЭК-56 при тех же условиях, что и при стандартизации эритроцитарной взвеси.

Расчет. При правильной постановке опытов и использовании свежих (негемолизированных) эритроцитов на завершающем этапе исследования оптическая плотность К2 должна находиться в пределах 0,66-0,74, в про-бирке с К1 – в пределах 0,01-0,03, в опытных – в пределах 0,35-0,55 еди-ницы шкалы прибора, т.е. в диапазоне минимальной ошибки фотометри-ческого измерения. В противном случае, экспериментально подбирается иная доза сыворотки (0,01, 0,02, 0,03, 0,04, ...) и при окончательном под-счете результатов делается соответствующая поправка.

Показатель комплементарной активности выражается в процентах по отношению к оптической плотности полного гемолиза (К2):

АК = (ДО×100)/ДК2, где

АК – активность комплемента, %;

ДО – оптическая плотность опытной пробы;

ДК2 - оптическая плотность К2.

Комплементарную активность обычно выражают в условных едини-цах по 50%-му гемолизу. В этом случае за единицу (ед. СН50) комплемен-тарной активности принимается такое количество комплемента в 1 мл сы-воротки, которое за 30 мин. инкубации в термостате при температуре 37°С вызывает 50%-ный гемолиз стандартной гемолитической системы.

Определение комплементарной активности рекомендуется проводить не раньше 8 ч и не позже 36 ч после взятия крови.

4.4.2.1 Модификация метода O. Barta и V. Barta определения гемоли-тической активности комплемента в сыворотке крови крупного рогатого скота

Установлено, что комплемент крупного рогатого скота обладает вы-сокой гемолитической активностью в системе, содержащей эритроциты морской свинки или кролика и гемолизин крупного рогатого скота (Barta O., Barta V., 1972).

Предлагается модификация  метода O. Barta и V. Barta на основе принципа колориметрии гемсистемы, содержащей эритроциты кролика и гемолизин крупного рогатого скота с использованием отечественных ма-териалов и приборов. При этом реакция выражается не в единицах гемо-литической активности с учетом титра исследуемой пробы, а в процентах гемолиза.

Принцип метода: Вносимое количество исследуемой пробы в опреде-ленный объем гемсистемы при инкубации вызывает гемолиз части индика-торных эритроцитов. На основе колориметрической оценки определяют процент гемолиза и соответственно активность системы комплемента сы-воротки крови.

Реактивы: 1. Веронал-мединаловый буфер (2,88 г веронала, 1,87 г мединала, 42,5 г натрия хлорида растворяют в 750 мл горячей воды, к этому раствору добавляют 1,5 мл 1М раствора кальция хлорида и 2,5 мл 1М раствора магния хлорида. Объем доводится до 1 л, рН – 7,4).

2. Гемолизин – сыворотка крови коров.

3. Эритроциты кролика.

4. 0,15 М NaCl.

В качестве гемолизина используют инактивированную сыворотку ко-ров, прогретую при 56оС в течение 30 минут, в которой предварительно определяется титр естественных гемагглютининов.

Реакцию гемагглютинации ставят в круглодонном микропланшете, смешивая в равных объемах от разных коров (по 50 мкл) разведенную 1:5-1:40 в физиологическом растворе сыворотку крови и 2% взвесь эритроци-тов кролика. Через 2 часа инкубации при 20-25оС отбираются сыворотки, образующие зонтики с титром не ниже 1:10, после инактивации их объеди-няют и хранят при -20оС.

Эритроциты кролика отмывают трижды: два раза физиологическим раствором и третий раз веронал-мединаловым буфером при 3000 об/мин. в течении 5 минут с расчетом, чтобы осадок эритроцитов в итоге составил 0,1 см3 . Готовят 4% взвесь эритроцитов, доводя объем до 2,5 мл веронал-мединаловым буфером, затем смешивают равные по объему 4% эритроци-ты и гемолизин в разведении 1:10 в буфере, инкубируют 45 минут при 20-25оС. Сенсибилизированные эритроциты отмывают трижды, последний раз буфером при 1500 об/мин. в течение 5 минут и готовят их 2%-ную взвесь в веронал-мединаловом буфере.

Ход определения. В пробирки поочередно вносят – 0,885 мл буфера, 0,015 мл исследуемой сыворотки и 0,1 мл 2% взвесь сенсибилизированных эритроцитов и встряхивают. Инкубируют в течение 1 часа при 37оС, два-жды встряхивая. По окончании инкубации пробирки центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 3 минут, надосадок удаляют, а осадок эритроцитов гемолизируют добавлением 1 мл дистиллированной воды. В три кон-трольные пробирки вносят по 0,1 мл 2% взвеси сенсибилизированных эритроцитов и по 0,9 мл дистиллированной воды.

Расчет. Активность реакции оценивают в процентах гемолиза изме-рением коэффициента пропускания (П) пробы, против дистиллированной воды на КФК-3, при длине волны 540 нм.

Определяют величину светопропускания исследуемых и трех кон-трольных проб. Вначале определяют процент гемолиза оставшихся эрит-роцитов, это связано с тем, что при наличии гемолиза в пробе, исключает-ся необходимость в постановке дополнительного контроля.

Строят график, откладывают на оси ординат снизу вверх значения в процентах гемолиза от 0 до 100%, на оси абсцисс слева направо – значе-ния П от 85 до 100.

На горизонтальной линии, соответствующей 100% гемолизу ставят точку среднего значения – П в трех контрольных пробах, от нее проводят линию к точке соответствующей значению – П равному 100 – на оси абс-цисс. Проекцией на прямую значений П пробы, вначале определяют про-цент гемолиза остаточных эритроцитов, его вычитают от 100% и вычис-ляют процент гемолитической активности комплемента в исследуемой сы-воротке крови.

Например: среднее значение П в трех контрольных пробах составило 88,5. При значении П остаточного гемолиза в исследуемой пробе 94,2, что при проекции на график соответствует 50,5% гемолиза. Разница между 100% и 50,5% составляет 49,5% гемолитической активности комплемента в исследуемой пробе.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021