4.4.1. Определение активности лизоцима в сыворотке крови

Принцип метода. Определение лизоцима основано на способности лизоцима сыворотки крови вызывать лизис бактерий Micrococcus li-sodeicticus.

Реактивы: 1. Фосфатный буфер (рН 7,2-7,4):

а) 0,06-М раствор однозамещенного фосфата калия (КН2РО4) готовят в мерной колбе вместимостью 100 мл, 0,9078 г КН2РО4 растворяют в би-дистиллированной воде;

б) 0,06-М раствор двузамещенного фосфата натрия (Na2НРО4) готовят в мерной колбе на 100 мл, 0,9476 г Nа2НРО4 растворяют в бидистиллиро-ванной воде;

в) рабочий раствор: для приготовления 100 мл (рН 7,2-7,4) смешива-ют 28 мл раствора КН2РО4 и 72 мл раствора Nа2НРО4.

2. Приготовление 4 млрд. микробной взвеси Micrococcus lisodeicticus: 0,6 мг ацетонового порошка культуры тщательно растирают в ступке в 1 мл буфера. Так, если предполагается исследовать количество проб 32, то-гда количество порошка: 0,6×32 = 19,2 мг. Взвесь стандартизируют по оп-тической плотности, которую измеряют на ФЭКе против раствора фосфат-ного буфера, используя зеленый светофильтр № 6 (длина волны 540 нм) в кюветах с длиной оптического пути 3 мм. Светопропускание исходной взвеси должно составлять 20 % (20 ед. черной шкалы правого барабана ФЭКа) против рабочего буфера. Это соответствует оптической плотности 4 млрд. взвеси культуры. Если %  светопропускания меньше – добавляют буфер, если больше – культуру.

Ход определения: в каждую опытную пробирку вносят микропипеткой 0,1 мл исследуемой сыворотки крови и прибавляют 1,4 мл стандартной культуры тест-микроба и встряхивают. Полученную смесь ставят в термо-стат на 1 час при температуре 37ºС. По истечении этого времени, пробир-ки вновь встряхивают и фотометрируют при условиях, аналогичных усло-виям стандартизации культуры. Отсчет показаний на ФЭКе также ведут в ед. светопропускания (по черной шкале).

Расчет: показателем активности лизоцима служит относительная ве-личина, равная разности между % светопропускания испытуемой смеси после часовой экспозиции и % светопропускаемости исходной взвеси.

Примечание. 1. Для определения активности лизоцима используют как нативную, так и инактивированную сыворотку. Инактивацию проводят в водяной бане при 56°С в течение 30 мин. с целью разрушения термола-бильных активных компонентов сыворотки.

2. Для выражения активности лизоцима можно остановиться на еди-ницах оптической разницы опыта и исходной культуры (в %). Полученные единицы иногда переводят в единицы активности – мкг/мл по калибровоч-ной кривой.

Построение калибровочной кривой. Из основного раствора лизоцима готовят рабочие растворы, необходимые для построения калибровочной кривой (табл. 2).

Таблица 2

Стандартные разведения для построения калибровочной кривой при определении активности лизоцима

проб

Основной раствор лизоцима, мл

Дистиллированная вода, мл

Содержание лизоцима в 1 мл раствора, мкг

Содержание лизоцима в 0,1 мл раствора, мкг

1

0,1

9,9

1

0,1

2

0,2

9,8

2

0,2

3

0,3

9,7

3

0,3

4

0,5

9,5

5

0,5

5

0,7

9,3

7

0,7

6

0,9

9,1

9

0,9

7

1,0

9,0

10

1,0

Из каждого разведения берут по 0,1 мл раствора и проводят опреде-ление оптической плотности при тех же условиях, что и при работе с сы-вороткой крови. Одновременно ставят отрицательную пробу – для этого вместо 0,1 мл стандартного раствора берут 0,1 мл дистиллированной во-ды. Строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат величину светопропускания, а на оси абсцисс – содержание лизоцима в 0,1 мл рас-твора в мкг. При этом нулевую точку устанавливают по показанию отри-цательной пробы. Найденное количество лизоцима по калибровочной кривой умножают на 10 и получают содержание лизоцима в 1 мл сыво-ротки.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021