5.1. Ферментативное звено антиоксидантной системы

Регуляция процесса переоксидации на стадии инициации осуществляется ферментами: супероксиддисмутазой и церулоплазмином (ферроксидазой); на стадии разветвления цепей: каталазой, пероксидазой и глутатионпероксидазами и глутатионтрансферазами. При этом восстановление окисленного глутатиона, образующегося в процессе взаимодействия глутатионзависимых антипероксидных систем, осуществляется глутатионредуктазой.

Супероксиддисмутаза (СОД) (КФ, 1.15.1.1.) занимает центральное место в системе ферментной антиоксидантной защиты организма. Она катализирует реакцию дисмутации супероксиданионрадикала с образованием пероксида водорода и молекулярного кислорода:

10

Поэтому СОД защищает аэробные организмы от повреждающего действия супероксида. Фермент обнаружен в нескольких внутриклеточных компартментах.

У эукариотных организмов обнаружено несколько изоформ фермента. В ядрах, цитоплазматическом матриксе, пероксисомах и межмембранном пространстве митохондрий и плазме крови животных содержится чувствительная к цианиду Cu,Zn -содержащая форма (C^Zn-СОД). Молекулярная масса Cu,Zn-СОД составляет 31кДа, молекула состоит из двух идентичных субъединиц, связанных дисульфидным мостиком. Каждая субъединица содержит один атом меди (Си +) и один атом цинка (Zn +). Предполагается, что цинк необходим для стабилизации молекулы, в то время как медь принимает непосредственное участие в дисмутации. Поверхность фермента несет отрицательный заряд, однако в строении молекулы выявлены положительно заряженные каналы, которые ведут к активным центрам и служат, как предполагается, для захвата отрицательно заряженных анионрадикалов. В результате такого избирательного захвата значительно повышается скорость реакции дисмутации.

Кроме того, в митохондриях и матриксе хлоропластов эукариот обнаруживается цианидрезистентная марганцевая форма (Mn-СОД), характерной особенностью которой является устойчивость к действию Н2О2 и индуцибельность. В межклеточных жидкостях существует высокомолекулярная цианидчувствительная экстрацеллюлярная форма (Э-СОД), представляющая собой Си, Zn-содержащий гликопротеин, состоящий из 4-х нековалентно связанных между собой субъединиц, молекулярная масса каждой из которых составляет около 30 кДа. Активный центр фермента содержит 4 атома меди и возможно столько же атомов цинка.

Наиболее древним в эволюционном плане является железосодержащий изофермент (Fe-СОД), представляющий собой димер, субъединицы которого равновелики и не связаны дисульфидными связями. При этом его активность значительно ниже активности Си^шсодержащей формы.

Активность СОД, как фермента играющего ключевую роль в создании антиоксидантной защиты организма, меняется в зависимости от парциального давления кислорода и индуцируется им.

В связи с тем, что субстрат СОД, которым является супероксиданионрадикал весьма нестабилен, выбор метода определения активности СОД имеет очень важное значение.

В настоящее время существует две основные группы методов определения активности СОД: прямое и косвенное. Методы прямого определения активности СОД (импульсный радиолиз воды, ЭПР и др.) основаны на измерении текущей или стационарной концентрации супероксиданионрадикала и их чувствительность ниже, чем чувствительность косвенных химических методов. В связи с этим наибольшее распространение получили косвенные методы, которые заключаются в том, что супероксиданион улавливается какойлибо индикаторной молекулой, превращающейся при этом в окисленную или восстановленную форму, а активность СОД определяется затем по ее способности ингибировать превращение улавливающей молекулы при действии О2*. В качестве систем, генерирующих супероксидный радикал используются реакции окисления ксантина ксантиоксидазой, окисления эпинефрина в адренохром, аутоокисление сульфита или пирогаллола, фотохимической генерации с использованием рибофлавина и ряд других. В качестве индикаторных "ловушек" используют цитохром С, тетранитрометан, нитросиний тетразолиевый, нитросиний тетразолиевый хлористый и другие вещества. Все косвенные химические методы определения активности СОД очень близки по чувствительности и воспроизводимости.

Существующие модификации методов различаются по источникам генерации супероксидного радикала и используемым индикаторам.

Подобно супероксиддисмутазе реакцию дисмутации О2* катализирует другой медьсодержащий белок - церулоплазмин (ЦП, ферро-О2-оксидоредуктаза, КФ 1.16.3.1) с молекулярной массой около 134 кДа, связывающий 90...95% сывороточной меди или около 3% всей меди организма. Каждая молекула фермента содержит 6 (7) прочно связанных ионов Си +, способных высвобождаться только при низких значениях рН и в присутствии восстановителя. Церулоплазмин проявляет каталитическую активность в отношении большого числа субстратов, эффективно окисляет ионы Fe2+, аскорбиновую кислоту, фенолы, амины, катехолы, и является одновременно ферроксидазой, аскорбатоксидазой и аминооксидазой. Связывание супероксиданион-радикалов церулоплазмином происходит с участием пары ионов меди. При этом происходит четырехэлектронное восстановление кислорода до воды, а не до пероксида водорода, как это происходит при действии СОД. В отличие от СОД, защищающей внутриклеточные структуры, церулоплазмин функционирует в крови и перехватывает свободнорадикальные формы кислорода, предохраняя таким образом от их повреждающего действия липидосодержащие биоструктуры.

Однако эффективность церулоплазмина в отношении связывания супероксиданиона примерно в 100 раз ниже, чем у СОД. Несмотря на это, в настоящее время церулоплазмин, количество которого в крови намного больше, чем СОД, рассматривается в качестве основного антиоксиданта плазмы крови. Особенностью этого белка является высокая стабильность к токсическому действию активных форм кислорода, что позволяет ему сохранять биологическую активность в условиях их интенсивной генерации.

Церулоплазмин проявляет как специфическую, так и неспецифическую антиоксидантную активность. Специфическая активность, связанная со снижением уровня активных метаболитов кислорода может протекать по следующим трем путям:

- церулоплазмин обладает ферроксидазной активностью, окисляя ионы Fe2+ до Fe . В результате этого снижается концентрация ионов двухвалентного железа, являющихся необходимым компонентом реакций свободнорадикального окисления на стадиях инициирования и разветвления цепи. Способность ЦП окислять Fe по оксидазному механизму, а также ингибировать ОН*, делает его наиболее эффективным сывороточным ингибитором реактивных метаболитов кислорода.

- он может вызывать дисмутацию О2*, которая имеет не ферментативный, а стехиометрический характер, со способностью перехватывать О2* связывают ингибирующее действие церулоплазмина на процессы пероксидного окисления липидов в хиломикронах и липопротеинах;

- он способен инактивировать активные формы кислорода, генерируемые миелопероксидазой. Неспецифическая антиоксидантная активность церулоплазмина обусловлена образованием прочных комплексных соединений с медью (до 95-96% всей меди плазмы).

Помимо антиокислительных функций церулоплазмин участвует в транспорте меди, мобилизации сывороточного железа для кроветворения, регуляции уровня биогенных аминов в сыворотке крови (окисление катехоламинов, оксииндолов). Он также является реактантом "острой фазы" при различных инфекционных заболеваниях, остром и хроническом воспалительных процессах, злокачественном росте, инфаркте миокарда и ряде других заболеваний.

В зависимости от целей исследования для определения активности или содержания церулоплазмина используют, в основном, две группы методов. Первая группа методов основана на антигенных свойствах церулоплазмина как белка и позволяет определять иммунореактивный церулоплазмин. Вторая группа методов основана на оксидазных свойствах церулоплазмина, как ферроксидазы и позволяет определять ферментативно активный церулоплазмин.

Образующая в результате реакции дисмутации супероксидных радикалов, катализируемой супероксиддисмутазой, а также другими путями, пероксид водорода является высокоактивным токсическим агентом. Если бы в клетке не было бы механизмов быстрого обезвреживания Н2О2, то она, реагируя с супероксиданионом, генерировала бы радикал гидроксила (ОН*), который чрезвычайно активно окисляет органический молекулы практически всех типов, полностью снимая антиоксидантный эффект СОД и церулоплазмина. Поэтому поддержание нормального уровня обмена Н2О2 и предотвращений ее накопления в клетках и тканях имеет жизненно важное значение.

Первоочередную роль в этом играют ферменты, которые избирательно катализируют разрушение ее молекул. В первую очередь это каталаза и различные пероксидазы, которые катализируют формально подобный тип реакции.

Каталаза (КФ 1.11.1.6) - гемсодержащий фермент с молекулярной массой около 250 кДа, разрушающий пероксид водорода без участия акцепторов кислорода, а донором электронов служит сам пероксид водорода. Она является наиболее активным из известных ферментов. По структуре фермент является тетрамером, содержащим по одной прочно связанной гемовой простетической группе на субъединицу.

Согласно современным представлениям, каталаза препятствует избыточному накоплению в клетках пероксида водорода посредством его разложения в ходе двух последовательных реакций:

11

При этом в окисленном состоянии фермент может работать как пероксидаза, катализируя окисление спиртов или альдегидов:

12

где

АН2 - донор электронов.

В физиологических условиях каталазная активнось примерно в 10 тыс. раз выше, чем пероксидазная и одна молекула фермента в секунду способна разложить до 44000 молекул перекиси водорода (Прайор У., 1979).

Каталаза широко распространена в организме животных, причем наибольшая активность фермента обнаружена в печени, эритроцитах и почках. В эритроцитах каталаза находится в комплексе с НАДФН. Динуклеотид не является необходимым для проявления специфической активности фермента, но он предотвращает его инактивацию. В клетках до 80% каталазы локализовано в пероксисомах, где ее концентрация достигает 10" М.

Функцией фермента является предотвращение накопления в клетках пероксида водорода, образующейся, в частности, при дисмутации супероксидного аниона и при аэробном окислении восстановленных флавопротеидов. Каталаза относится к ферментам, которые наиболее длительно сохраняют свою высокую активность, почти не требует энергии активации, а скорость реакции, катализируемой этим ферментом, лимитирует лишь скорость диффузии субстрата к активному центру каталазы.

Несмотря на столь высокую активность фермента, до сих пор нет чувствительного способа ее определения, доступного для широкого исследования в лабораторной практике. Применяемые титрационные методы имеют низкую чувствительность, к тому же они довольно сложны и трудоемки.

Кроме этого, существует еще ряд методов, например, с использованием кислородного электрода Кларка, полярографические методы, однако они требуют специальной аппаратуры. Наиболее приемлемыми с точки зрения чувствительности и техники исполнения являются спектрофотометрические методы, основанные на измерении концентрации Н2О2 в инкубационной среде, либо по максимуму поглощения самой Н2О2, либо по поглощению ее окрашенных комплексов с солями некоторых металлов в ультрафиолетовой области спектра.

При низких концентрациях Н2О2 разлагается группой ферментов - пероксидазами, которые отличаются друг от друга субстратами, которые используются в качестве доноров водорода. Эти ферменты высоко специфичны только к пероксидазной группировке и в большинстве случаев мало специфичны по отношению к донору водорода. К этой группе ферментов относится НАДН - пероксидаза (КФ 1.11.1.1.), НАДФН-пероксидаза (КФ 1.11.1.2.), цитохромпероксидаза (КФ 1.11.1.5), классическая пероксидаза (КФ 1.11.1.7), глутатионпероксидаза (КФ 1.11.1.9) и другие пероксидазы.

Пероксидаза (КФ 1.11.1.7) в отличие от каталазы содержит всего одну гемовую группу на одну молекулу фермента. Также как и каталаза, пероксидаза восстанавливает Н2О2 до воды, используя в качестве доноров водорода фенолы, амины, органические кислоты. На этом основано большинство методов определения активности пероксидазы, например, по изменению окраски при окислении бензидина пероксидью водорода.

В животных тканях пероксидаза распространена не так широко, как каталаза. Наибольшая активность пероксидаз выявлена в тонком и толстом кишечнике, селезенке и легких. Пероксидазная активность крови обусловлена, в основном, ее наличием в гранулоцитах. В тоже время пероксидазы, в частности, миелопероксидаза, адсорбируясь на мембранах фагоцитированных бактерий генерирует альдегиды, синглетный кислород (1О2), другие свободные радикалы, которые повреждают клетки.

Пероксидаза может окислять полиненасыщенные жирные кислоты с образованием гидропероксидей и малонового диальдегида. В связи с этим ее значение в системе антиоксидантной защиты организма остается пока неясным.

Ведущее место в ферментативном звене антиоксидантной защиты организма, обеспечивающим защиту от повреждающего действия пероксидей различной природы, принадлежит глутатионпероксидазе, являющейся одним из компонентов антипероксидного комплекса, включающего глутатион и глутатионредуктазу и осуществляющую восстановление окисленного глутатиона, образующегося в процессе функционирования глутатионзависимых антипероксидных систем.

Глутатионпероксидаза - селеносодержащий фермент катализирующий превращение пероксида водорода и органических гидропероксидов до гидросоединений, которые в дальнейшем могут метаболизироваться клеточными системами. Фермент представляет собой тетрамер, состоящий из 4-х идентичных сферических субъединиц с молекулярной массой около 19 кДа. Каждая субъединица содержит по одному атому Se, входящему в состав селеноцистеиновых остатков и расположенному в активном центре каждой субъединицы. Фермент имеет 2 активных GSH-связывающих центра. Для инактивации пероксида водорода, разложения и детоксикации гидропероксидов и органических перекисей, прежде всего, липидных и фосфолипидных, в клетках высших животных существует селенсодержащая глутатионпероксидаза (ГПО, КФ 1.11.1.9).

Глутатиопероксидаза катализирует реакцию восстановления глутатионом (GSH) нестойких органических гидропероксидов, включая гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), в стабильные соединения - оксикислоты (ROH):

13

Все изоферменты ГПО способны также утилизировать и H2O2:

14

До 70% ГПО локализовано в цитозоле, и около 20-30% - в митохондриях всех клеток млекопитающих. Известны селеновые изоферменты: внеклеточная ГПО, обнаруженная в плазме и молоке, особый изофермент ГПО1, выделенный из цитозоля клеток печени и кишечника, ГПО гидроперекисей фосфолипидов. Кроме того, обнаружен также неселеновый изофермент (ГПО2), идентичный глутатион^-трансферазе (КФ 2.5.1.18).

Согласно схеме циклического трех этапного механизма действия глутатионпероксидазы (ГПО 1), на первом этапе селенол E-SeH сначала восстанавливает гидропероксидь ненасыщенной жирной кислоты ROOH в жирную гидрокси-кислоту ROH, которая подвергается (3-окислению или взаимодействует с мультиферментным комплексом синтетазы жирных кислот. Сам селенол в активном центре фермента (Е) окисляется в селениновую кислоту E-Se (O) OH. На втором этапе "окисленный" фермент образует с глутатионом (GSH) комплекс, реагирующий на последнем этапе со второй молекулой GSH с образованием глутатиондисульфида GSSG и исходной формы селенола в активном центре фермента. Помимо селеносодержащей глутатионпероксидазы (ГПО1) в организме животных обнаружена глутатионпероксидаза, не содержащая селена (ГПО2). Она имеет молекулярную массу 45000 и иные физикохимические и каталитические свойства. В отличие от ГПО1, активно катализирующей превращение Н2О2 и органические гидропероксиды, ГПО2 обладает субстратной специфичностью только к органическим гидропероксидам. На этом отличие основано раздельное определение активности ГПО1 и ГПО2. В качестве субстрата для определения активности ГПО1 используется пероксид водорода, а для определения активности ГПО2 чаще всего используют гидропероксид изопропилбензола или кумола.

ГПО2 идентичная ферментам семейства глутатион^-трансфераз, которые в большей степени связаны с детоксикацией продуктов ПОЛ, генерирующихся в эндоплазматическом ретикулуме при метаболизме ксенобиотиков. Кроме этого, глутатион^-трансфераза может непосредственно катализировать детоксикацию ксенобиотиков посредством переноса на них атомов серы от глутатиона с последующим образованием меркаптидов - соединений серы с металлами, меркаптуровых кислот, а также глутатионпроизводных чужеродных веществ.

Видовые и органные особенности активности ГПО2, в частности, значительное превалирование ее активности в печени большинства животных над ГПО 1, указывает на явную антиоксидантную функцию ГПО2 и, по-видимому, объясняют относительную толерантность ряда видов животных к дефициту селена.

В целом антиоксидантный эффект ГПО1 и ГПО2 в цепи пероксидного окисления липидов, инициируемого свободными радикалами с участием активных форм кислорода заключается в следующем. Селеносодержащая глутатионпер-оксидаза (ГПО1) предотвращает продолжение процесса пероксидного окисления липидов, во-первых, обезвреживая уже образовавшиеся гидропероксиды жирных кислот и, во-вторых, предупреждает их образование, расщепляя Н2О2, которая, реагируя с супероксидным анионрадикалом, генерирует радикал гидроксила, чрезвычайно активно окисляющий органические молекулы всех типов.

Поскольку селеннезависимая глутатионпероксидаза (ГПО2) не расщепляет Н2О2, она участвует в антиоксидантной защите мембранных липидов, взаимодействуя с гидропероксидями жирных кислот. ГПО2 сначала с помощью глутатиона (G-SH) катализирует превращение гидропероксида жирной кислоты в промежуточное соединение типа R-O-SG. Далее из второй молекулы GSH и остатка первой молекулы GSH, вошедшей в состав промежуточного соединения, образуется глутатиондисульфид (GSSG), представляющий окисленную форму глутатиона.

Восстановление окисленного глутатиона (GSSG), образующегося в глутатионпероксидазной реакции, осуществляется с участием глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.8.1.7) и систем восстановления НАДФ +, в частности, в процессе пентозофосфатного пути окисления глюкозо6-фосфата. Поддержание достаточного уровня восстановленного глутатиона необходимо для поддержания функционирования глутатионзависимого звена антиоксидантной системы (рис.4):

15

Рис.4. Глутатионзависимое звено антиоксидантной системы

Глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2) имеет молекулярную массу около 44000 Да и локализована, в основном, там же, где и антипероксидные глутатионзависимые ферменты. В качестве доноров водорода для восстановления окисленного глутатиона, главным образом, используется НАДФН, но может использоваться и НАДФ.

16

Активность глутатионредуктазы существенным образом зависит от обеспеченности организма рибофлавином. Наибольшая активность фермента обнаружена в почках, тонком кишечнике, эритроцитах. В зависимости от задач исследования и наличия реактивов активность глутатионредуктазы определяют либо по убыли в среде инкубации восстановленных пиридиннуклеотидов (НАДФН или НАДН) или по увеличению количества восстановленного глутатиона. Оба метода достаточно специфичны, дают воспроизводимые результаты, но отличаются друг от друга выражением единиц активности фермента.

Помимо описанной выше системы основных ферментов антиоксидантной системы организма, ограничивающих процесс пероксидного окисления липидов на разных его стадиях система антиоксидантной защиты включает в себя и неферментативное звено, состоящее из низкомолекулярных эндогенных антиоксидантов.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2019