РОД ENTEROVIRUS - ЭНТЕРОВИРУС СВИНЕЙ 6 СЕРОТИПА

Энтеровирусы свиней являются представителями группы вирусов, первично размножающихся в желудочно-кишечном тракте, и которые затем могут реплицироваться в других тканях организма животных. В лабораторных условиях энтеровирус свиней культивируют в перевиваемой культуре клеток СПЭВ.

Для получения концентрированных образцов вируса для электронной микроскопии и других целей используют различные методы. Одним из подобных методов является модифицированный нами метод ультрафильтрации через полупроницаемые мембраны. Процесс очистки и концентрирования включает в себя два этапа: первый - осветление вирус -содержащей суспензии центрифугированием с последующей обработкой её полиэтиленг-ликолем (ПЭГ) и получением 5-10-кратных концентратов вируса; на втором этапе концентрат вируса очищали хлороформом и использовали для ультрафильтрации через плоские полупроницаемые ацетатцеллюлозные мембраны "Владипор" типа УАМ-500 с диаметром пор 50 нм.

В зависимости от объёма вирусного материала из комплекта фильтров мембранных типа ФМ-02 с внутренним объёмом стаканов 10, 200 и 1000 мл выбирали соответствующий и проводили процесс ультрафильтрации при избыточном давлении воздуха над мембраной 0,2-0,4 МПа. В целях уменьшения отрицательных воздействий на структуру вирионов и сокращения потерь вируса концентрирование вели в режиме статической ультрафильтрации, то есть без перемешивания жидкости над поверхностью мембраны до полного перехода жидкости в ультрафильтрат. В результате этого на поверхности мембраны образуется гелеобразная тончайшая пленка вирусного концентрата, который, при добавлении буферного раствора в установку, смывали с поверхности путем простого взбалтывания при покачивании установки. После элюции вируса концентрированную суспензию очищали хлороформом с последующим центрифугированием при 1500-2000 g.

21

Рис. 21. Структурные компоненты вируса ВЕС в форме смешанно контрастированных 150S частиц, «пустых» капсид и фрагментов белковой оболочки, х 350000.

Простота и доступность основных технологических приемов получения высококонцентрированных препаратов вируса в виде гелеобразной пленки на поверхности мембраны и возможность полной элюции вирусных частиц придает этому методу особую привлекательность при работе с небольшими объёмами вируссодержащей суспензии.

Однако данный метод получения высококонцентрированных суспензий вируса имеет один недостаток: концентрат вируса трудно сохранить длительное время в жидком состоянии. Из данных литературы известно и подтверждено опытным путем, что замораживание очищенных и концентрированных препаратов с целью консервации вируса сопровождается его разрушением, что исключает данный вариант хранения.

Для предотвращения разрушения вируса в составе гелеобразной пленки вирусного концентрата нами использован 20-30%-й раствор сахарозы. Сущность метода стабилизации проста и заключается в том, что по окончанию процесса ультрафильтрации, то есть при полном переходе жидкости в ультрафильтрат и образовании на поверхности мембраны концентрата вируса в форме белковой пленки, на установке снимали избыточное давление и заливали раствор сахарозы из расчета полного покрытия поверхности мембраны (10-15 мл). В установке затем вновь создавали избыточное давление и полностью пропускали раствор сахарозы через мембрану.

Мембрану, без признаков влаги на её поверхности, извлекали из установки, сворачивали для компактности несколько раз и помещали в фарфоровую чашку. Для охлаждения мембраны в чашку приливали 50-70 мл жидкого азота и остекленевшую мембрану с помощью пестика растирали до порошкообразного состояния в течение 2-3 мин. Затем порошок переносили в стеклянный флакон и хранили под плотно закрытой пробкой при температуре минус 10-20°С до момента использования.

Полученные таким образом обезвоженные порошки, содержащие вирус в концентрированном виде, были названы нами для краткости как концентрат-порошки. Для извлечения вируса концентрат-порошок регидра-тировали в буферном растворе и, после осветления центрифугированием (500 g) или простым отстаиванием, надосадочную жидкость использовали как для электронной микроскопии, так и для других целей [Пономарев А. П. и др., 1996].

Электронно-микроско пические исследования и результаты титрования подтверждают эффективность концентрирования вирусов вышеуказанным методом. При титре энтеро-вируса свиней в исходной вируссодержащей суспензии 6,5-7,0 lg ТЦД5о/мл ПРИ концентрировании в 1000 раз по объёму титр вируса возрастает до 9,25-10,0 lg ТЦД50/Мл- При этом сохраняется целостность вирионов, а их концентрация возрастает до 10'° частиц/мл (рис. 22а). Вариации размеров вирионов в пределах 25-35 нм, средний диаметр — 29 нм. Нанесение и контрастирование вирусных препаратов для электронной микроскопии с использованием поляризованных пленок-подложек сопровождается образованием у вирионов смешанного контраста (рис. 226).

Возможными вариантами применения концентрат-порошков, содержащих, например, инактивированный вирус, является использование их в качестве антигена при получении гипериммунных сывороток, в качестве референс-препарата - при типировании вирусов методом иммуноэлектронной микроскопии и других целей.

Иммунная электронная микроскопия энтеровируса. Термин иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ) обычно используется для обозначения комплекса методических приемов, позволяющих в конечном итоге визуализировать эффект взаимодействия антигена с антителами. Большой серией работ было показано, что метод ИЭМ с успехом применяется для выявления и серотипирования вирусов при предельной концентрации вирионов — 104-105 частиц/мл [Королев М. В., 1980; Lee Т. W. etal, 1996].

К числу задач, решаемых методом ИЭМ, относится также проверка сывороток рекон-валесцентов на наличие специфических антител к определенному вирусу. Для этой цели использовали референс-препараты в виде разведенных буфером в 100 раз концентрат-порошков, содержащих инактивированный антиген энтеровируса свиней с заведомо известной концентрацией вирионов и не превышающей 5-7 частиц в поле зрения электронного микроскола. Для лучшего разрешения структуры вирионов сыворотку предварительно' осветляли центрифугированием при 2000 g в течение 30 мин. Из осветленной части сыворотки готовили разведения 1:10, 1:100, 1:500 и 1:1000 и смешивали с разведенным антигеном энтеровируса в равных объёмах. После перемешивания смесь инкубировали при +37°С в течение часа и затем в течение ночи при +4°С.

Далее смесь центрифугировали при 2000 g в течение 30 мин для осаждения иммунных комплексов, полностью отсасывали жидкость из пробирок, а осадок ресуспендировали в 30-50 мкл буферного раствора и наносили на поддерживающие пленки-подложки. Препараты негативно контрастировали и исследовали под электронным микроскопом.

22

Рис. 22. Электронные микрофотографии энтеровируса свиней 6 типа:

Активность сыворотки оценивают по предельному её разведению, при котором в суспензии образуются специфические комплексы из большого количества вирусных частиц. На рис. 22в представлено изображение наиболее характерного комплекса антиген - антитело при разведении испытуемой сыворотки 1:500. Обработка аналогичных препаратов вируса нормальной сывороткой морских свинок не вызывала агрегацию вирионов, и в таких препаратах отмечалось наличие преимущественно отдельно расположенных вирионов.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2020