КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СТРУКТУРЕ ВИРИОНОВ ВИРУСА ЯЩУРА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НЕКОТОРЫХ ФИЗИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Известно, что функциональная активность вирионов на этапе взаимодействия и проникновения вируса в клетку обусловлена силами электростатической природы, то есть вирусные частицы в физико-химическом плане представляют собой микроаккумуляторы электрической энергии, обладающие суммарным электрическим зарядом определенной величины и полярности [Рюкерт Р. Р., 1989]. Электрический заряд вирусных частиц как биосистем, белковый капсид которых состоит из отдельных неидентичных блоков - полипептидов VP1, VP2 и VP3, возможно охарактеризовать, исходя из принципа суперпозиции, позволяющего оценивать действие системы фиксированных зарядов путем непосредственного сложения однотипных зарядов [Рубин А.Б., 1987; Пономарев А.П. и др.. 1992].

Данные литературы свидетельствуют о том, что электрический заряд вирусных частиц, определяемый по их электрофоретичес-кой подвижности, претерпевает изменения при длительном хранении концентрированных препаратов вируса, при воздействиях формальдегида, трипсина, хлористого цезия и других факторов внешней среды [Gard S., 1960]. По-видимому, при воздействии внешних факторов происходит дестабилизация энергетической компоненты в структуре вирионов, связанная с конформационными изменениями в составе вирусных белков и, как следствие, частичная или полная утрата вирусом его биологических свойств.

Современные представления о структуре белковых макромолекул включают в себя признание того факта, что в осуществлении жизненного процесса первостепенную роль играют конформационные изменения, взаимосвязанные с внутримолекулярной подвижностью структурных элементов молекул белка. При этом переход белка из одного кон-формационного состояния в другое осуществляется в рамках отдельных белков-доменов. Установлено, что оптимальные условия для функционирования белков наблюдаются вдали от их изоэлектрической точки [Турове-ров К.К., Кузнецова И.М., 1998].

Воздействие на вирус ящура отрицательных температур. Известно, что вирус ящура в определенных условиях обладает устойчивостью к многократному воздействию низких температур, и использование для целей консервации и длительного хранения вирусных препаратов сверхнизкой температуры наиболее предпочтительно. В опытах по проверке влияния сверхнизкой температуры вы-сокоочищенные суспензии вируса ящура А22-550 подвергали 5-кратному замораживанию-оттаиванию при температуре жидкого азота (-196°С).

По результатам исследований было установлено, что после замораживания в препаратах, помимо двух основных типов вирусных частиц с умеренно и интенсивно окрашенными позитивными участками, выявляются еще два вида частиц. Это вирионы с негативно окрашенным локусом на фоне позитивно контрастированного участка и вирионы, измененное состояние которых выражается сменой контраста с позитивного на негативный (рис. Па). Наблюдение смены контраста становится возможным благодаря появлению разделяющей бороздки, отчетливо просматриваемой при "боковой" ориентации вирионов на подложке.

11

Рис. 11. Электронные микрофотографии вируса ящура из препаратов, подвергнутых замораживанию-оттаиванию при различных температурах:

Конформационные изменения в структуре вирионов, при сохранении целостности последних (размеры основной массы вирусных частиц остаются в пределах от 25,7 до 28,3 нм), сопровождаются снижением титра вируса с 9,0 до 8,0 lg LD50/Mjl, то есть потеря инфекционной активности составляла 90%.

Замораживание-оттаивание очищенных и концентрированных препаратов вируса ящура (рис. 116) при температуре минус 10°С приводило к разрушению большей части вирионов до структурных субъединиц в виде фрагментов белковой оболочки или 12S частиц. У сохранившихся вирионов отмечались конформационные изменения, выражаемые сменой позитивного контраста на негативное окрашивание участка белкового капсида, функционально активного по отношению к анионам ФВК. Инфекционная активность вируса при этом снижается на 2-3 порядка.

Смена контраста свидетельствует о перезарядке данного фрагмента белковой оболочки с плюса на минус и о начальной стадии его отделения от структуры полного вирио-на, завершающегося разрушением 146S частиц. Более выраженная степень повреждения и разрушения вирионов при данной температуре, по сравнению с температурой -196°С, по-видимому, связана с относительно низкой скоростью охлаждения и, как следствие, более продолжительным временем пребывания вирусных частиц в зоне неравновесного фазового перехода "лед-вода". Вполне вероятно, что продолжительное по времени воздействие градиента электрического потенциала на границе «лед-вода» на заряженные вирусные частицы приводит к разрушению последних при температуре минус 10°С [Ка-чурин Л.Г. и др., 1967; Маэно Н., 1988; Опарин Ю.Г., 1996].

Воздействие на вирус ящура положительных температур. При оценке стабильности 146S частиц при длительном хранении концентратов вируса при температуре +4°С и + 37°С исследованиями различных авторов установлено снижение инфекционных и имму-ногенных свойств вируса. Это обусловлено расщеплением протеазами пептидных связей между положительно заряженными аминокислотными остатками структурного белка -полипептида VP1 [Barteling S.J., Wagenaar F., 1979; Doel Т. R., Collen Т., 1982].

Из результатов электронно-микроскопических исследований следует, что при хранении концентрированных препаратов вируса при температуре +4° и +26°С в структуре вирионов происходят изменения, связанные с появлением негативно контрастированных или отрицательно заряженных точек и локу-сов на позитивно окрашенном участке вири-она (рис. 12). При контроле инфекционной активности данных препаратов отмечено уменьшение титра вируса на 2-4 lg LD 50/мл, что позволяет предположить о наличии взаимосвязи данного конформационного изменения в структуре вирионов с функциональной активностью вируса.

Воздействие на вирус ящура нейтрализующих антител. Нарушение функциональной активности вируса происходит также при его взаимодействии с нейтрализующими антителами. По данным литературы, механизм иммуноинактивации вируса ящура объясняется, по меньшей мере, тремя факторами: а) агрегацией вируса, приводящей к неспецифической адсорбции на клеточной поверхности; б) ингибицией прикрепления вируса к чувствительным клеткам; в) неизвестным, проявляющимся после адсорбции, механизмом [Baxt К. et al., 1984].

В наших исследованиях для целей имму-ноэлектронной микроскопии вируснейтрали-зующие антитела получали методом аффинной хроматографии, так как использование нативных антисывороток при нейтрализации приводит к грубому склеиванию антигенов, что ограничивает возможности данного метода. В опытах специфические антитела выделяли из иммунной противоящурной сыворотки крупного рогатого скота с использованием активированной цианогенбромидом сефа-розы 4В. По результатам иммуноэлектрофо-реза и дискового электрофореза в ПААГ выделенные антитела были отнесены к классу IgG. Электронно-микроскопическими исследованиями нам не удалось выявить морфологически выраженную структуру антител: чаще всего в поле зрения периодически просматривались "сетчатые" аморфные скопления белковой природы, что подтверждалось наличием у данных структур негативного контраста.

Стандартная методика иммунной электронной микроскопии заключается в смешивании вирусной суспензии с гомологичной антисывороткой, что сопровождается формированием в смеси иммунных комплексов, состоящих из вирусных частиц, покрытых «венчиком» антител. Специфическая агрегация вирионов обеспечивает уверенную индикацию и идентификацию вирусов. Высокая чувствительность связана с тем, что образование иммунных агрегатов в процессе приготовления препаратов обусловлена увеличением концентрации вирионов в пределах микропреципитатов [Мамедов М. К. и др., 1982].

12

Рис. 12. Образование негативно контрастируемых локусов на участке белковой оболочки вирионов с позитивным контрастом в препаратах вируса, хранившихся при температуре +4° С (а) и +26" С (б) в течение 3 мес. х 350000.

13

Рис. 13. Характерные комплексы антиген-антитело, состоящие из 146S частиц вируса ящура и гомологичных антител: в однослойных (а) и многослойных (б) агрегатах вирионы сохраняют свою морфологию, так как в их структуре просматриваются интенсивно и умеренно позитивно контрастированные участки, х 350000 и 200000.

Суспензии, содержащие 146S частицы вируса ящура в концентрации 107-108 частиц/ мл (5-10 вирионов, одновременно наблюдаемые в поле зрения электронного микроскопа), смешивали в соотношении 1/0,5 с суспензией, содержащей антитела с концентрацией белка 300-400 мг%. Через 1-2 часа после смешивания готовили препараты для электронно-микроскопических исследований.

Результаты исследований показали наличие агрегатов из вирусных частиц, которые формируются в суспензии и адсорбируются на пленке-подложке в виде одно- и многослойных комплексов. В составе однослойных комплексов наиболее отчетливо просматриваются вирионы, сохраняющие свои характерные морфологические признаки в виде умеренно и интенсивно контрастируемых позитивных участков (рис. 13). В состав крупных комплексов антиген-антитело включается большое количество вирионов с беспорядочным наслоением их друг на друга. Трудности разрешения структуры вирионов в многослойных комплексах, по-видимому, обусловлены строением антител класса IgG, которые, как известно, реагируя с поверхностью вирусных частиц, образуют комплексы с нечеткими контурами вирионов [Brown F., Smale С. J., 1970].

Агрегирование вируса при смешивании со специфическими антителами не происходит при высокой ионной силе среды суспенди-рования. Удаление избытка солей диализом восстанавливает способность вирионов к формированию агрегатов. Эти данные согласуются с известным положением о причастности высокой ионной силы буферных растворов к разрушению белковых комплексов, в частности, комплексов вирус-антитело, что непосредственно указывает на участие в их образовании сил электростатической природы, так как связывание антител с участками белковых молекул определяется их формой и электрическим зарядом [Лернер Р. А., 1983].

Сформированные комплексы антиген-антитело подвергали воздействию повышенных температур, выдерживая последние при температуре +37°С. Электронно-микроскопические наблюдения через каждые 24 часа показали постепенный распад агрегатов до полного их исчезновения после 96-120 часов экспозиции. Распад агрегатов сопровождался конформационными изменениями в структуре вирионов, что выражалось появлением на поверхности позитивно контрастирован-ных участков белковой оболочки негативно окрашенных локусов (рис. 14). Наиболее отчетливо перезарядка фрагмента белковой оболочки в виде негативно окрашенной точки просматривалась на фоне интенсивно окрашенного позитивного участка.

Из результатов опытов следует, что in vitro иммуноинактивация вируса проходит два этапа: взаимодействие вируса ящура с гомологичными антителами сопровождается агрегированием вирусных частиц. Это приводит к уменьшению титра вируса на 3-4 порядка относительно исходной инфекционной активности вируса без явных деструктивных признаков в структуре вирионов. Диссоциация комплексов антиген-антитело при тепловом воздействии приводит к функциональным изменениям в структуре вирионов. По-видимому, распад комплексов и потеря инфекционной активности обусловлены конформационными изменениями в структуре вирионов, являющимися следствием действия на вирус специфических антител. Появление негативных локусов на фоне позитивно контрасти-руемого участка свидетельствует о перезарядке части белковых группировок, что вызывает изменение суммарного электрического заряда вирионов. Эти данные подтверждаются сведениями из литературы на примере поли-овируса. Для данного вируса установлено, что при наличии нейтрализующих антител в антисыворотке изоэлектрическая точка вирионов изменяется от 7 до 4, то есть процесс нейтрализации сопровождается изменением их суммарного электрического заряда [РюкертР. Р., 1989].

Таким образом, при воздействии различных по природе внешних факторов в структуре вирионов вируса ящура отмечаются идентичные изменения, выражаемые видимыми на электронных микрофотографиях конформационными перестройками в структуре функционально активного участка белкового капсида, образованного из молекул полипептида VP 1. Данное положение подтверждается теорией симметрии, согласно которой все преобразования совершаются на уровне элементов, идентичных в том или ином отношении [Шубников А. В., Копцик В. А., 1972].

Электронно-микроскопическое изображение 146S частиц вируса ящура, различающихся по интенсивности позитивно контрастируемого участка белкового капсида, характеризует вирионы как напряженные биосистемы, находящиеся в состоянии устойчивого неравновесия. Характер конформационных изменений позволяет оценивать повреждающие воздействия с энергетических позиций (смена заряда, появление отрицательно заряженных локусов), что является первопричиной частичной или полной утраты вирусом его биологических свойств и возможного последующего разрушения вирионов.

14

Рис. 14. Конформационные изменения в структуре вирионов из распавшихся комплексов антиген-антитело: на фоне интенсивно и умеренно контрастированных позитивных участков образуются негативно окрашенные локусы. х 250000.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2021