Глава 2. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ, ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА PICORNAVIRIDAE РОД APHTHOVIRUS - ВИРУС ЯЩУРА

Возбудитель ящура является первым идентифицированным вирусом и до настоящего времени продолжает оставаться актуальной проблемой для животноводства. Различают семь антигенных типов вируса ящура (А, О, С, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1) и несколько десятков вариантов. Благодаря всесторонней изученности данный вирус является базовой моделью для изучения вирусных болезней животных.

Вирус ящура характерен, в основном, для парнокопытных:, но был выделен также не менее чем от 70 видов млекопитающих. Наиболее типичные клинические проявления инфекции, вызванные вирусом, характеризуются везикулярным поражением слизистых оболочек рта, миокарда, скелетной мускулатуры, кожи венчика и вымени.

По морфологическим признакам вирус ящура относится к «просто» организованным. Вирион состоит из РНК и белковой оболочки. Для электронно-микроскопических исследований готовят очищенные и концентрированные вируссодержащие суспензии в соответствии с задачей конкретного опыта. В условиях негативного контрастирования 3%-м раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) рН 6,8 под электронным микроскопом JEM-100В наблюдаются светлые ви-рионы на темном фоне контрастирующего вещества (рис.3). На данной микрофотографии негативно контрастированные вирусные частицы соответствуют общеизвестной характеристике основного структурного компонента вируса ящура, представленного полными ви-рионами или 146S частицами в форме однородных во всех направлениях и симметрично построенных биосистем. Морфологических различий между представителями 7 серотипов вируса ящура электронно-микроскопическим путем не установлено.

При нанесении вирусных препаратов из высокоочищенной концентрированной суспензии на поверхности пленки-подложки образуются плотные однослойные скопления вирионов, имеющих вид шестиугольников. Структура вирионов просматривается с характерной шероховатостью и несколько напоминает форму ягоды ежевики (рис. 4) [Узю-мов В. Л., 1970; Надточей Г. А. и др., 1972]. Одним из объяснений образования шестиугольной конфигурации вирионов является то, что при нанесении вирусных препаратов из высокоочищенных и концентрированных суспензий на поверхности пленки-подложки возникает усилие от мениска высыхающей на воздухе капли контрастирующего вещества, вызывающего сдвиг частиц, следствием чего является формирование плотных однослойных скоплений. Для плотной упаковки одинаковых сфер на плоской поверхности действует закон минимальной длины, из которого следует, что каждая частица, соприкасаясь по касательной с шестью другими, образует правильную шестиугольную или гексагональную конфигурацию с контурами минимальной длины [Вейль Г., 1968].

Морфологию частиц вируса ящура возможно наблюдать как в целом состоянии, так и на различных стадиях их разрушения. На рис. 5а представлена электронная микрофотография структурных компонентов вируса ящура: целые вирионы или 146S частицы, пустые капсиды или 75S частицы и фрагменты пустых капсид или 12S частицы.

Структурная неоднородность вирионов проявляется в некоторой вариации их размеров — от 20 до 30 нм (средний диаметр 24,5 нм), в заполнении капсида вирионной РНК, которая занимает всю внутреннюю полость и просматривается в вирионах как электронно-прозрачное ядро, часть РНК и её полное отсутствие, что сопровождается образованием пустых капсид (рис. 56). Данная микрофотография иллюстрирует морфологическую вариабельность вирионов, характеризуемую не только сохранением целостности частиц, но и содержанием РНК в их составе.

Визуазьное представление о характере разрушения биосистемы вирионов на два основных структурных компонента — ядро РНК и фрагменты белковой оболочки, отражено на рис. 5в. При распаде вирионов сохраняется целостность ядер РНК, которые могут находиться как в окружении отслоившейся оболочки, так и на стадии полного их разобщения'и в свободном состоянии.

Контрастирование вирусных препаратов раствором ФВК рН 3,0 позволяет наблюдать распад белковой оболочки на составляющие её фрагменты при сохранении формы сферы (рис. 5г). Резкое изменение рН вирусной суспензии на пленке-подложке в кислую зону вызывает нарушение баланса действующих сил в структуре вирионов и, как следствие, их разрушение. Среди продуктов распада отсутствует РНК в том виде, как она фиксируется при распаде вирионов и контрастировании ФВК рН 6,8.

4

Рис. 3. Электронная микрофотография негативно контрастированных 146S частиц вируса ящура. При свободном расположении на поверхности пленки-подложки вирионы всегда представлены сферическими структурами, х 350000.

5

Рис. 4. Гексагональная конфигурация вирионов вируса ящура в плоских однослойных скоплениях, х 350000.

6

Рис. 5. Морфология структурных компонентов вируса ящура:

Результаты экспериментальных исследований и данные литературы указывают на то, что отличительной чертой «просто» устроенных вирионов вируса ящура является высокая степень их внутренней упорядоченности. Это выражается в повторяющейся правильности внешних очертаний и идентичности размеров вирионов. Известно, что тела изометрической формы обладают бесконечным числом осей и плоскостей симметрии, что затрудняет их описание. В обобщенном плане методами электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа достаточно полно представлена структурная организация изометрических вирусных частиц с обоснованием икосаэдрической модели их строения [Клименко С. М., 1982J.

Относительно исследований структурной организации с использованием рентгено-структурного анализа П.М.Зоркий (1996) отмечает, что этот метод дает возможность физически корректно построить непрерывное пространственное распределение электронной плотности г (г) и вычислить функцию г (х, у, г), которая строится в предположении сферической симметрии атомного рассеяния, и поэтому исследуемому объекту априори приписывается определенная структура. Из литературы следует, что модели изометрических вирусов на основе симметрии икосаэдра, полученные с использованием данных рентгеноструктурного анализа, представляют собой математическое описание абсолютно симметричных структур. Однако сведения о применении такой модели для расшифровки и понимания механизмов устойчивости, инактивации и функционирования вируса во внешней среде в доступной нам литературе не обнаружены.

Электронно-микроскопические исследования структурных компонентов вируса ящура позволяют охарактеризовать структурную организацию вирусных частиц как способ пространственного расположения составляющих элементов с образованием высокоупорядоченных биосистем в форме вирионов. Однако характеристика структурной организации вируса ящура полностью не раскрывает особенностей строения вирусных частиц, неотъемлемым свойством которых является их специфичность. Абсолютизация структурной организации вирионов, основанная на принципах симметрии икосаэдра, больше подходит для описания статических структур. Полной симметрии, за исключением абстрактных математических построений, в природе не существует. Всюду симметрии сопутствует асимметрия [Депенчук Н.П., 1963; Бейли Н., 1970; Eisenberg D., 1982].

Общеизвестные представления о структуре вируса ящура, основанные на данных электронной микроскопии, преимущественно отражают архитектурное построение целых вирионов и их структурных компонентов. Согласно принципу системного подхода эти данные характеризуют одну сторону строения вирусных частиц — их структурную организацию, основным признаком которой является геометрическая форма вирионов, которая вместе с операциями совмещения дает структурную симметрию. Выявление и описание другой части понятия «структуры вируса ящура» - функциональной организации вирионов или их асимметрии, в литературе не отмечается.

При этом совершенно очевидно, что функциональная организация вируса не может исчерпываться только определением компонентного состава вирусных частиц. Известно, что вирионы вируса ящура наряду с РНК содержат четыре структурных полипептида -VP1, VP2, VP3 и VP4, различающиеся но функциональным свойствам, молекулярной массе, величине и знаку заряда. Асимметричная молекула РНК не имеет в капсиде определенной ориентации, но вместе с тем её присутствие оказывает стабилизирующее действие на капсид [Denoya CD. et al, 1978].

Литературные данные указывают на то, что проблема локализации различных блоков при изучении электрической структуры твердых тел, включая и биологические объекты, может быть решена с помощью электронной микроскопии. Это становится возможным при условии избирательного осаждения декорирующих веществ на электрически активные поверхности твердых тел [Дистлер Е.И., 1972; 1976]. Данные обстоятельства свидетельствуют о принципиальной возможности поиска путей выявления электрически активных участков поверхности вирусных частиц, которые для биологических объектов проявляются в разделении зарядов и распределении различных полярных групп [Тимашев С. Ф., 1988]

На основе данных электронно-микроскопических исследований нами была получена качественно новая информация о строении 146S частиц вируса ящура, характеризующаяся обнаружением позитивно и негативно контрастированных участков поверхности белковой оболочки вирионов (рис. 6). По чисто внешним признакам данный вид контраста вирусных частиц был назван нами как "смешанный", и который имеет общий характер для вирионов вируса ящура независимо от системы его культивирования (аф-тозный, культуральный, лапинизированный). В структуре вирионов позитивно контрасти-рованный участок чаще всего представлен в форме шарового сегмента и занимает 30-40% всей поверхности. При этом расположение вирионов на пленке-подложке следует охарактеризовать как двояко ориентированное: боковое, определяемое по положению позитивно окрашенного сегмента относительно поверхности подложки, и произвольное, характеризуемое положением позитивного сегмента у вирионов относительно друг друга. Визуальное сравнение негативно и смешанно контрастированных вирионов свидетельствует о том, что смешанный контраст наблюдается у вирионов, расположенных на участках пленки-подложки с наиболее плотным слоем контрастирующего вещества [Пономарев А.П. и др., 1979].

7

 

Рис. 6. Морфология смешанно контрастированных вирионов вируса ящура: по положению позитивного участка вирионы ориентированы одинаково по отношению к поверхности пленки-подложки и произвольно - относительно друг друга, х 300000.

8

Рис. 7. Среди общей массы вирионов с умеренно окрашенным позитивным участком присутствуют вирионы с интенсивно окрашенным позитивным участком, х 350000.

9

Рис. 8. Единичные вирионы с интенсивно окрашенным позитивным участком присутствуют среди частиц с негативным контрастом, х 350000.

Выраженное размежевание положительно и отрицательно заряженных участков в структуре вирионов отражает их функциональную организацию или анизотропию строения. Морфологической особенностью феномена смешанного контрастирования вирусных частиц является то, что среди основной массы вирионов с умеренно окрашенным позитивным участком просматриваются отдельные частицы с интенсивно окрашенным позитивным участком. Под словом «окрашенные» здесь следует понимать эффект сорбции анионов ФВК, содержащих атом вольфрама, на участки оболочки вирионов с различной плотностью положительно заряженных белков. Единичные вирионы с интенсивно окрашенным позитивным участком выявляются также и на фоне негативно контрастированных частиц (рис. 7,8).

Сложная пространственная организация биологических макромолекул, в том числе и вирусных частиц, не может быть до конца осознана без обсуждения вопроса поведения биологических макромолекул на межфазных границах, вблизи которых возникают градиенты различных физических свойств. Из анализа условий подготовки препаратов для электронной микроскопии следует, что к формированию у вирионов смешанного контраста причастны два основных фактора. Елав-ный фактор — это поляризующее воздействие на структуру вирионов неравновесных условий фазового перехода, усиливаемого наведенной полярностью твердых поверхностей, и второй — это влияние повышенной плотности (давления) на вирионы монослоя контрастирующего вещества, образуемого на пленке-подложке при испарении жидкости [Пономарев А. П., 2000]. На рис. 9 представлена схема формирования электронно-микроскопического изображения вирусных частиц в различных условиях внешнего окружения. Позитивное контрастирование вирионов анионным «красителем» ФВК возможно в случае положительного заряда белковой оболочки. Воздействие на вирионы ФВК рН 3,0 приводит к смене заряда оболочки вирионов с отрицательного в слабощелочной среде рН на положительный заряд в кислой среде. Кратковременность воздействия позволяет сохранить целостность вирионов, и анионы ФВК покрывают всю их поверхность с образованием позитивного контраста. Такой характер взаимодействия «красителя» с белковой оболочкой приводит к увеличению размеров вирионов на 2-3 нм по сравнению с их изображением при негативном и смешанном контрастировании.

Как отмечают Е. В. Орлова и Н. А. Киселев (1986), при негативном контрастировании изображение частиц зависит от степени их погружения в слой электронно-плотного вещества. Поэтому можно предположить, что чисто негативный контраст возникает при неполном погружении вирионов в электронно-плотный слой, который образуется на пленке-подложке при испарении остатка раствора ФВК. Неполное погружение позволяет выявить в основном внешнюю конфигурацию вирусных частиц и в определенной степени предохраняет их структуру от повреждения при высыхании. В данном случае изображение молекул на микрофотографиях рассматривается как картина распределения контрастирующего вещества вокруг исследуемой частицы.

В случае полного погружения, когда при испарении остатка раствора ФВК толщина электронно-плотного вещества становится соизмеримой с диаметром вирионов, изображение формируется всей их поверхностью, что увеличивает вероятность образования у вирионов смешанного контраста.

В данных условиях контрастирования величина рН сохраняется в зоне слабощелочного значения, а выявление положительно заряженного участка оболочки обусловлено поляризующим воздействием электрического поля твердой поверхности (рис. 9в). Данное предположение подтверждается результатами определения размеров вирионов с различным контрастом. Негативно кон-трастированные вирионы культурального вируса ящура, например, типа 0-194, имеют 'диаметр 24,9±0,4 нм, смешанно -24,3±0,4 нм (замер более 500 частиц каждого вида). Уменьшение диаметра вирионов при смешанном контрастировании против негативно окрашенных и сохранение различий в размерах на одну величину (0,6 нм) для разных типов вируса ящура указывает на зависимость размеров вирионов от степени погружения и некоторого сдавливания их слоем контрастирующего вещества.

10

Рис. 9. Моделирование формирования контраста вирионов в различных условиях. Вид сбоку в разрезе и вид сверху: а - позитивный контраст; б - негативный; в - смешанный; г - глубокое погружение вирионов в слой ФВК. / Рис. 10. Вирионы вируса ящура при глубоком погружении в слой контрастирующего вещества, х 450000.

Фактически для вирусных частиц установлено свойство их поляризуемости при воздействии внешнего электрического поля, возникающее на границе раздела двух фаз. При испарении контрастирующего раствора на пленке-подложке его концентрация и вязкость увеличиваются, что в той или иной степени предотвращает деформацию объекта. В соответствии с данными литературы об электростатическом взаимодействии заряженных белков со сложными анионами ФВК осаждение последних на соответствующие белки позволяет визуально выявлять вирионы, различающиеся по плотности электроположительно заряженного участка [Брусков В.И., 1968].

При избыточном количестве контрастирующего вещества на пленке-подложке возможен вариант глубокого погружения частиц в электронно-плотный слой. При этом «краситель» проникает внутрь вирионов с расчленением их компонентов (рис. 10).

В физическом представлении понятие «поляризуемость» подразумевает некоторое явление, в результате которого однородная или нейтральная структура становится неоднородной, и у неё появляются явно выраженные полюсы, участки, где концентрируются ранее равномерно «размазанные» свойства, такие, как электрический заряд. При этом поляризация может быть представлена двумя компонентами, одна из которых мгновенно следует за приложенным внешним полем, а другая — квазипостоянна и равна электрическому моменту вмороженных ориентированных диполей или микроскопически смещенных зарядов внутри молекул. Хорошо известны и электрические диполи, системы, где наблюдаются участки с концентрацией положительных и отрицательных зарядов. Существуют структуры с постоянно выраженными полюсами, в частности с двумя полюсами — диполи, и структуры, у которых в нормальном состоянии полюсов нет, но они появляются при каком-либо внешнем воздействии, например, во внешнем электрическом поле [Дебай П., Закк Г., 1936; Сесслер Г., 1983].

Дипольная поляризация к настоящему времени найдена в большинстве важнейших биополимеров — белках, полисахаридах и по-линуклеотидах, которая связана с наличием у них электретных свойств. По аналогии с физическими электретами процесс накопления или исчезновения поляризации является функцией температуры. Биофизические явления могут длиться от долей секунды до многих лет, поэтому характерное электретное время жизни или время распада поляризации является важным параметром. Установлено, что при пониженной температуре время исчезновения поляризации может измеряться столетиями [Маскаренас С, 1983].

Результаты электронно-микроскопических исследований позволяют заключить, что популяция вирионов вируса ящура представлена гетерогенными частищами, различающимися но степени проявления их поляризации.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2020