НАНЕСЕНИЕ И КОНТРАСТИРОВАНИЕ ВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Последовательность нанесения и контрастирования вирусных препаратов схематично представлена на рис. 2. На поверхность чистой фторопластовой пластинки помещали отдельные капли образцов вируссодержащих суспензий (поз. 1). Предварительно фторопластовую пластинку поляризовали или облучением УФ-лучами не менее 30 мин (расстояние до бактерицидной лампы не более 25 см), или путем интенсивного натирания её поверхности сухой тканью. Известно, что при трении диэлектрики электризуются за счет удаления с поверхности слоя ионов, компенсирующих их электрический заряд.

Сверху на каплю опускали сеточку пленкой-подложкой вниз и адсорбцию вирусных частиц проводили в течение 3-5 мин (поз. 2). Затем сеточку снимали с капли и фильтровальной бумагой удаляли избыток жидкости (поз. 3-4) с таким расчетом, чтобы на поверхности оставалась едва заметная пленка жидкости (поз. 5). После этого на сеточку наносили каплю 3-4%-го раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) рН 6,8 (поз. 6). Через 20-30 сек фильтровальной бумагой удаляли с поверхности сеточки избыток жидкости (поз. 7). После досушивания на воздухе (поз. 8) негативно контрастированные препараты исследовали под электронным микроскопом.

Негативное контрастирование применяется преимущественно при исследовании бактерий, вирусов и других микроорганизмов, но не годится для ультратонких срезов. Сущность данного способа контрастирования заключается в том, что биологический объект на пленке-подложке окружается тонким слоем «красителя», который не окрашивает, а создает вокруг него темный фон, сильно рассеивающий электроны. В момент контрастирования «краситель» может также проникать в промежутки между структурными составляющими объекта, способствуя выявлению тонких деталей строения последнего. Метод негативного контрастирования до настоящего времени остается ведущим при прямой электронной микроскопии биологических объектов.

В отличие от негативного позитивное контрастирование основано на электрофизическом взаимодействии ионов «красителя» с противоположно заряженными группами белковых макромолекул. Наиболее часто для целей позитивного контрастирования используют водные 1-2%-е растворы уранилацетата (рН 4,3) или ФВК (рН 4,0). В этом случае «краситель» покрывает поверхность макромолекул, которые выглядят темными на светлом фоне пленки-подложки [Уикли В., 1975; Маняков В. Ф., 1979].

Другие детали техники приготовления препаратов заинтересованные исследователи могут найти во многих методических работах по электронной микроскопии. Важнейшей задачей микроскописта является умение и способность увидеть на полученном изображении объекта те новые существенные детали, которые несут в себе прямую или косвенную информацию об его структуре, свойствах, имевших место превращениях и, главное, максимально правильно истолковать увиденное.

3

Рис. 2. Последовательность операций нанесения и контрастирования вирусных препаратов для электронно-микроскопических исследований.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2020