1.2. Методы индикации и идентификации микоплазм

Микоплазмы очень нежные, прихотливые к питательным средам и рН микроорганизмы, поэтому, несмотря на широкое распространение их в природе, имеется ряд трудностей в методике их выделения, идентификации и дифференциации от I.-форм бактерий.

В течение ряда лет создавались методические рекомендации по работе с микроорганизмами класса Mollicutes: микробиологическая и иммунологическая диагностика миконлазмо-пневмонии инфекции, Алма-Ата, 1978; методические рекомендации по выделению, культивированию, поддержанию и идентификации микоплазм, ахолеплазм и уреаплазм, ВАСХНИЛ - Москва, 1982; генитальный микоплазмоз крупного рогатого скота, Новосибирск, 1982; методические рекомендации по выделению и идентификации микоплазм из молока коров, ВАСХНИЛ - Москва, 1985; методические указания по диагностике, профилактике и мерам борьбы с микоплазмозом свиней, ГУВ МСХ СССР Москва, 1988. В данных рекомендациях авторы указывали на актуальность проблемы и необходимость ознакомления практических ветеринарных и медицинских специалистов с основными методами диагностики, особенностями клинико-морфологической картины и мерами борьбы с этой болезнью. Различия между методами состоят в видовой характеристике (животные: крупный рогатый скот, мелкий рогатый скот, свиньи или человек) и от формы проявления болезни (конъюнктивальная, суставная, легочная, урогенитальная). В зависимости от этого, есть принципиальные отличия во взятии биоматериала и первичной его обработки с целью выделения микоплазм, а также сопутствующей микрофлоры, являющейся ассоциирующей в течение всего им-., фекционного процесса. Микробиологические и иммунологические подходы в диагностическом плане остаются неизменными, к ним относятся бактериологический метод индикации микоплазм на жидких и плотных питательных средах, а также дальнейшая типизация в серологических или иммунологических тестах, ДНК-диагностика.

Ученые В.Д. Тимаков, Г.Я. Каган в своих многочисленных работах отмечали, что изучение микоплазм и Е-форм бактерий необходимо проводить комплексно не отрывая друг от друга. Касаясь методик выделения этих микроорганизмов, они указывали, что при работе с клиническим материалом надо создавать такие условия анализа, которые гарантировали бы непосредственное выделение каждого агента из организма. Ученые выяснили (1973), что «...одновременные посевы на среды, содержащие индуцирующий L-формы фактор, и на среды, не содержащие его, повышенной или обычной осмотической концентрации оказались эффективными для непосредственной изоляции разнообразных дефектных по клеточной стенке агентов из клинического материала».

В связи с изложенным, Э.А. Шегидевич (1976) предложил новую схему исследования патологического материала на наличие микоплазм, суть которой:

а) при выделении необходимо отказаться от употребления ингибиторов - пенициллина и уксуснокислого таллия; для очистки исследуемых объектов от бактериальных контаминантов целесообразно использовать фи зические методы - фильтрацию и центрифугирование, которые в прошлом с успехом применяли исследователи, изучавшие перипневмонию крупного рогатого скота, плевропневмонию коз, агалактию овец и коз и т.д.;

б) при выделении микоплазм необходимо проводить полный бактериологический анализ исследуемого объекта, используя для этого набор питательных сред различных прописей.

Данная методика была взята за основу многими исследователями, которые занимались изучением микоплазмоза сельскохозяйственных животных.

П.М. Митрофанов (1982) рекомендует добавлять к питательным средам пенициллин в дозе 1000 ЕД/мл и ацетат таллия (в конечной концентрации 1:2000) для подавления бактериальной флоры при первичном посеве биоматериала, а для исключения L-форм бактерий проводить 3-5 последовательных пассажей выделенных культур с 5-дневными интервалами на сывороточных питательных средах без ингибиторов для восстановления исходных форм бактерий.

СИ. Борхениус, О.А. Чернова (1989) предлагают методы обнаружения и идентификации в клеточных культурах:

1) посев на специальные среды;

2) электронная микроскопия;

3) люминесцентная микроскопия в сочетании с окраской ДНК;

4) обычная световая микроскопия с авторадиографией;

5) введение Б-метилпуриндезоксирибозида (БМПДР) непосредственно в культуральную среду;

6) иммунологические с использованием нефракционирован-ных антисывороток, поли- и моноклинальных антител;

7) гибридизационные с использованием РНК и ДНК.

Ю.В. Вульфович, И.В. Раковская, Н.А. Гамова и др. (1995) для сравнительной оценки различных методов лабораторной диагностики урогенитальных микоплазмозов и уреаплазмозов при различных клинических формах этих инфекций, а также выяснения степени участия Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в развитии анализируемых патологических процессах, использовали различные методы диагностики. Микробиологический, то есть посев на питательные среды, пригодные для культивирования микоплазм и уреаплазм; серологические методы обнаружения антигенов возбудителей и антител к ним, а также метод обнаружения специфических антигенов в мазках-отпечатках исследуемых тканей с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ). С помощью непрямой РИФ выявляли антигены возбудителей в мазках-отпечатках, приготовленных из отделяемого уретры, влагалища и цервикального канала. Для серологического выделения микоплазменных антител возбудителей использовали реакцию агрегат-гемагглютинации (РАГА), а для определения титров специфических антител - реакцию пассивной гемагглютинации (РИГА). Данный комплекс используемых лабораторных методов, по мнению авторов, достаточно эффективен для диагностики урогенитальных микоплазмозов и уреагшазмозов. Вместе с тем при исследовании материала в каждом случае целесообразен дифференцированный подход в зависимости от клинического диагноза у данного больного.

Д.Г. Дерябин, С.Д. Борисова, СВ. Михайленко (2000), утверждали, то что урогенитальная инфекция на современном этапе характеризуется высоким удельным весом микст-инфекций. Микробиологические анализы направленные на обнаружение только одного из возможных инфекционных агентов, являются вероятной причиной «просмотра» микроорганизмов аесоциантов, которые после элиминации выявленного возбудителя обуславливают сохранение инфекционного процесса.

Т. А. Гасанова (2001), подтверждает их данные и считает, что хронические воспалительные заболевания, обусловленные многокомпонентными паразитоценозами, включающими представителей разных таксономических групп (бактерии, вирусы, грибы, простейшие), нужно диагностировать не только с помощью качественных и количественных характеристик микроорганизмов, но гак же наряду с ними необходимо применение других критериев -функциональных для описания микроэкологического статуса репродуктивной системы. Рекультивируемые и переиетентные формы микроорганизмов очевидно не могут быть этиологически значимой, лидирующей флорой, определяющей клинические проявления и тяжесть инфекционного процесса в следствии низкого уровня метаболизма и следовательно вирулентности. Таким образом, если микроорганизм и его антиген определяется с помощью иммунофлюоресценции (ИФ), иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ill (Р), ДНК-гибридизации, но не изолируются в культуре клеток или изолируются в яерсистентной форме, то он вряд ли может быть этиологически значимым компонентом. У микроорганизма - «лидера» должен быть высокий уровень метаболизма и вирулентности. Поэтому для диагностики паразитоценоза урогенитального трак-га при хронических воспалительных процессах необходимо использовать лабораторные тесты двух уровней: тесты 1-го уровня (скрипигирующне) для качественной характеристики паразитоце-нозов и тесты 2-го уровня культуральные для их количественной и функциональной характеристики. К тестам 1-го уровня'относятся: микроскопия мазков с окраской по Граму и Романовскому 1 имзе для общего представления о паразитоценозе; индикация возбудителей методами прямой и непрямой ИФ, ИФА или ГПДР. ДНК-зондов; серологическое исследование методом ИФА и ИФ. Тестами 2-го уровня, позволяющими определить уровень метаболизма патогенов, являются классические культуральные либо быстрые культуральные методы с цитированием возбудителя с помощью моноклональных антител (МАТ) или поликлональных антител (ПАТ). Последний является не только более быстрым, но и более точным, специфичным, и чувствительным методом определении патогенов в биологическом материале. Такая двухуровневая диагностика позволяет получить исчерпывающую информацию о качественной, количественной и метаболической характеристике паразитоценозов урогенитального факта.

X. Zheng, К. Тан. М. Frazier, G.H. Cassell, II.Т. Watson (США, 1996) изучали детерминант переменной периодически повторяющейся области антигена MB Ureaplasma urealyticum, предварительно идентифицировав ее методом иммунепятнистого анализа и моноклональными антителами.

С. Gil-Juarez, В.A. Calderon, J. Montero, A. Yanez, L. Cedillo (1996), Мексика, индикация микоплазм и уреаплазм осуществлялась культуральным методом, а видовая идентификация - ПЦР.

Во Франции (Т. Schaeverbeke, Н. Renaudin, 1997) систематическое детектирование микоплазм производили с помощью куль-турального метода и ПЦР, при этом в каждой исследуемой пробе проводили титрацию возбудителя в клиническом материале.

P. Yu, F. Ни, X. Shi, F. Wang, M, Shu, X. Мао, ученые из Китая, в 1998 году для диагностики хронического простатита, вызванного Chlamydia trachomatis и

Ureaplasma urealyticum использовали следующие методы: иммунофлюоресценции, моноклинальных антител и выделение культуры на специальных питательных средах.

В.И. Кнзина и др. (2000) для постановки диагноза на уреа-плазмоз использовали следующие методы: клинический, микробиологический, эндоскопический и ультразвуковой.

Анализ данных отечественной и зарубежной литературы в отношении различных методик индикации и идентификации возбудителя из первичного материала показывает1, что в основном современная диагностика микоплазмоза основывается на иммунологических и бактериологических подходах. Полученные пер--вичные изоляты на специальных питательных средах для роста микоплазм подвергают дальнейшим исследованиям с помощью экспресс-методов: ИФ, ИФА, моноклональных антител МАТ или поликлональиых антител ПАТ ДНК-зондов; ПЦР. Последний является не только более быстрым, но и наиболее точным, выявляя минимальное количество микоплазмеиной ДИК.

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2020