Хранение и размораживание спермы хряков

Ситуация, сложившаяся в свиноводстве в течение последних лет, выявила потребность во внедрении новых технологий в сфере искусственного осеменения. Наиболее актуальным вопросом является срок сохранности спермы племенных хряков. На данный момент при использовании высококачественных разбавителей производства Минитюб (Minitiib, Германия) сперма может сохранять свои качества до десяти дней, но для серьезной племенной работы этого недостаточно. Следующим шагом в данном направлении является криоконсервация спермы хряков.

Технология заморозки спермы хряков для длительного хранения только набирает обороты в мире, и в том числе, в Украине. Мы предлагаем Вам ознакомиться с ее базовыми понятиями и основными процессами.

1. Работа с жидким азотом и контейнерами с жидким азотом

1.1. Свойства жидкого азота
Жидкий азот - бесцветная жидкость с температурой кипения -196°С, химически инертен. Скорость испарения жидкого азота зависит от типа криогенного контейнера для хранения и системы его изоляции. Независимо от системы изоляции, жидкий азот постоянно испаряется из криососуда. При лучшей изоляции емкости, интенсивность испарения меньше, чем в сосудах с меньшей изоляцией.

1.2. Криогенные контейнеры
Криогенные контейнеры изготавливаются из алюминия или нержавеющей стали и имеют встроенные системы изоляции. Крышки для горловин рассчитаны на поддержание в резервуаре давления, равного внешнему. Падение криогенной емкости или повреждение ее внешнего кожуха могут ухудшить теплоизоляцию.

1.3. Обучение
Прежде чем начинать работать с жидким азотом, весь персонал (супервайзеры и техники), который будет работать с криогенным материалом, должен ознакомиться со свойствами жидкого азота и пройти подготовку по технике безопасности, транспортировке и способам оказания первой помощи. Обучение повторяют регулярно с интервалом в 6 месяцев, и на занятиях должны присутствовать даже временные работники, и частично занятые рабочие.

1.4. Контроль уровня жидкого азота
"Время хранения" для емкости с жидким азотом зависит от ее размера и количества времени, в течение которого она открыта для извлечения образцов. Регулярный мониторинг уровня жидкого азота очень важен для предотвращения высыхания емкости и потери ее содержимого. Это можно обеспечить использованием одного из следующих методов:
Определение потери веса. Регулярно взвешивайте емкость, чтобы определить потери в весе: общий вес = пустая емкость + содержимое для хранения + жидкий азот.

Учет. Необходимо вести строгий учет литров жидкого азота (807г/литр) при полной емкости и любых изменений, касающихся содержимого.

Градуированная "линейка" (сантиметры). Использование данного устройства требует соответствующего обучения и осторожности при применении. Чтобы точно измерить уровень жидкого азота, необходимо, чтобы линейка коснулась дна емкости и оставалась в жидком азоте в течение нескольких секунд. По мере извлечения линейки на погруженном участке будет образовываться иней, по которому и можно определить уровень жидкого азота.

Если уровень приближается к критической отметке, немедленно дозаправьте емкость. Жидкий азот можно приобрести у коммерческих поставщиков, в Центрах по ИО, или у коллег, в случае срочной необходимости.

2. Хранение спермодоз в специальных емкостях, их извлечение и перенос

2.1. Колебания температуры могут ухудшить качество замороженной спермы
Степень повреждения спермиев зависит от степени изменения температуры, времени и частоты.

Обратите внимание, что после однократного воздействия негативного фактора снижение прогрессивной подвижности составляет почти 25%. После 10 раз подвижными остаются менее 20% спермиев. Клеточные повреждения носят необратимый и кумулятивный характер. Для оптимального хранения замороженных сперматозоидов необходимы температуры ниже - 120°С. В криогенных емкостях с пробками, закрывающими горловину, температуру ниже -120°С можно получить, только если уровень жидкого азота составляет 10 или более сантиметров.

Всегда существует опасность повреждения спермодоз во время их переноса из одной криогенной емкости в другую. Чтобы избежать возможного повреждения, необходимо запомнить следующее:
• Избегайте колебаний температуры при нахождении спермодоз в сосуде с жидким азотом;
• Температура спермы будет повышаться, когда «стакан» поднимают до уровня горловины емкости;
• Опасность нагревания и потенциального повреждения зависит от высоты, на которую поднят «стакан»;
• «Стакан» следует поднимать только до той точки, откуда можно извлечь соломинки с подвески при помощи специально разработанных щипцов;
• Не поднимайте спермодозы выше уровня горловины криогенной емкости;
• Если Вы не можете быстро извлечь то, что Вам нужно, попросите ассистента подержать подвеску на необходимой высоте, используя прищепку для белья или аналогичный зажим, пока будут извлекаться соломинки со спермой;
• Не поднимайте соломинки со спермой до уровня горловины просто для того, чтобы прочесть надписи на их этикетках;
• Аккуратно ведите инвентарную опись содержимого криогенной емкости и четко указывайте там номера и количество стаканов и соломинок, чтобы уменьшить время их поиска и извлечения.

2.2. Сперма не защищена от повреждения в горловине криогенной емкости

3. Размораживание спермы
Использование правильной процедуры размораживания спермы важно для сохранения жизнеспособности спермы и успешного осеменения.

3.1. Основные принципы
Продолжительность размораживания: После того, как соломинку со спермой извлекли из емкости с жидким азотом, ее следует немедленно перенести в водяную баню при рекомендуемой температуре. Размораживание "на воздухе" или "в кармане" не соответствует требованиям и отрицательно сказывается на жизнеспособности спермиев.

Температура: Температура спермы должна постепенно повышаться с момента, когда ее извлекают из емкости с жидким азотом, и в период всего процесса размораживания.

Нельзя допускать, чтобы температура размороженной спермы понижалась. Любое понижение температуры приведет к необратимому повреждению спермиев. Избегайте воздействия на сперму исключительно высоких температур, постоянно контролируя температуру водяной бани, и не допускайте нахождения соломинок в водяной бане сверх рекомендуемого времени. Не размораживайте больше соломинок, чем это необходимо для получения спермодозы для осеменения, при этом размораживайте одновременно не более 2-3 соломинок.

Поэтому, если для получения дозы спермы необходимо 6-12 соломинок, может понадобиться размораживать их несколькими порциями и добавлять сперму в тюбик/пробирку для спермодоз по мере размораживания. Размороженную спермодозу готовят и немедленно используют в течение максимум 20 минут. Сперма, использованная сразу после размораживания, имеет более высокие потенциальные возможности в плане фертилизации.

Чистота: Сперма не должна вступать в непосредственный контакт с водой во время всего процесса размораживания. После того, как соломинки извлекут из водяной бани, их следует насухо протереть чистым бумажным полотенцем.

3.2. Процесс размораживания спермы
Все оборудование, используемое для размораживания спермы и приготовления спермодоз, следует готовить заранее, до начала процедуры размораживания.

Сперму необходимо как можно быстрее перенести из криогенной емкости непосредственно в Размораживатель (водяную баню).

Не размораживайте более 2-3 соломинок по 0,5 мл одновременно. Следуйте инструкциям поставшика спермы относительно количества соломинок, необходимых на 1 дозу для искусственного осеменения (6-12 соломинок/доза).

Рекомендации по размораживанию:
• соломинки 0,5 мл: Размораживать на водяной бане при +37°С в течение 20 секунд (время, необходимое для прогревания спермы до температуры +26°С). Следите, чтобы время не превышало 20 секунд.
• Макросоломинки объемом 5,0 мл: Размораживать на водяной бане при +50°С в течение 45 секунд. Насухо протрите соломинки чистым бумажным полотенцем. Встряхните соломинку, чтобы пузырек воздуха передвинулся к запаянному кончику, который нужно обрезать. Держите соломинку вертикально (пузырьком воздуха вверх) и откупоривайте соломинку, отрезая ее конец чистыми ножницами или ножом для соломинок. Избегайте непосредственного контакта спермы с режущим инструментом. Опорожните открытую соломинку в предварительно прогретый тюбик (+26°С), протолкнув хлопковую пробку или шарик для укупоривания при помощи наконечника в сторону открытого кончика, для переноса спермы в тюбик.

Повторяйте эти шаги до тех пор, пока в тюбике не окажется необходимый объем спермодозы. Дозы для искусственного осеменения содержат в целом по 4 млрд. спермисв. Это соответствует 8 соломинкам по 0,5 мл или одной макросоломинке объемом 5 мл.

Размороженную сперму доводят до объема конечной дозы 60-70 мл добавлением дополнительного количества разбавителя, предварительно подогретого до 26°С.

Запечатайте тюбик со спермой, используя зажим или термическую герметизацию.

Опытные техники могут размораживать соломинки объемом 0,5 мл при +50°С в течение 15 секунд. Эта процедура несколько улучшает качество размороженной спермы. Однако следует внимательно контролировать время размораживания и температуру, чтобы избежать повреждения спермиев.

3.3. Оценка подвижности размороженной спермы
Возьмите 1 мкл разведенной спермы. Поместите ее на предварительно подогретое (+37°С) предметное стекло, накрытое покровным стеклом, и проведите оценку подвижности. Используйте фазово-контрастный микроскоп с нагревательным столиком. Для точной оценки подвижности следует обеспечить температуру предметных и покровных стекол или счетных камер на уровне +37°С.

Наиболее объективную оценку спермы дает использование Sperm Vision® производства фирмы Минитюб (Германия).

4. Осеменение размороженой спермой
Поскольку жизнеспособность спермиев после размораживания "короткая", то спермодозы следует использовать для осеменения в течение 20 минут после размораживания. Успех программы искусственного осеменения размороженной спермой в значительной степени зависит от качественно проведенного процесса осеменения.

Для успеха осеменения необходимы:
- правильное содержание и уход за свиноматками;
- достоверное выявление половой охоты;
- выбор оптимального времени для осеменения с учетом овуляции;
- техника осеменения.

Наилучшие результаты получают при проведении осеменения в период до 4-х часов до предполагаемой овуляции. Поэтому необходимо точно знать период наступления половой охоты, чтобы правильно определить время овуляции.

4.1. Содержание и уход за свиноматками
Свиноматки должны быть здоровыми, в хорошем физическом состоянии, и у них не должно быть заболеваний, которые могут повлиять на фертильность.

4.2. Выявление половой охоты
Выявление животных в охоте проводят минимум 2 раза в день, в идеале 3 раза в день, или каждые 8 часов. Наилучшие возможные результаты можно получить только тогда, когда осеменение проводится максимально близко ко времени овуляции. Ультразвук является хорошим инструментом для выявления наличия и роста фолликулов в яичниках, а затем определения оптимального времени для осеменения. Осеменение следует начинать, когда размеры фолликулов составляют 9-11 мм. Животных не следует осеменять после того, как ультразвук не обнаружил фолликулов в яичниках. Это надежный признак того, что овуляция произошла в период между одним ультразвуковым исследованием, когда были обнаружены фолликулы 9-11 мм, и вторым, когда фолликулы не были обнаружены. Рекомендуется проводить ультразвуковое исследование каждые 6-8 часов.

4.3. Техника осеменения
Независимо от типа используемого катетера для осеменения, очень важно тщательно соблюдать правила гигиены и использовать соответствующую технику осеменения. Фермы могут принять решение использовать катетеры для цервикального осеменения, такие как SafeBlue и FoamTip™. Применение внутриматочного осеменения предпочитают на фермах, где имеется опыт использования ВМО с помошью катетера для ВМО от Minitiib.

Животных осеменяют в соответствии с практикой, применяемой на ферме, каждые 6-8 часов, до тех пор, пока свиноматка не перестанет демонстрировать позу половой охоты (прогибание спины) или проявлять рефлекс "неподвижности". Может также практиковаться программа осеменения с интервалами 8-12 часов; однако результаты могут оказаться не такими хорошими, как хотелось бы.

5. Синхронизация охоты и овуляции
Единственным способом определения времени для проведения осеменения, без использования многократных процедур выявления половой охоты, является программа синхронизации половой охоты и овуляции. Однако применение данной программы не гарантирует, что у всех животных овуляция наступит в рамках планируемого графика. Поэтому, в целях оптимизации результатов беременности, рекомендуется осеменять размороженной спермой 2 раза. Третье осеменение может использоваться, если свиноматка все еще находится в активной половой охоте.

В последнее время многие хозяйства используют ультразвуковые приборы, дающие изображения. Эти приборы позволяют получить на экране изображения плода в роге матки с 20-го дня. Благодаря получению изображения плода, неверные или отрицательные результаты полностью исключены. Исключение результатов, которые ошибочно считались положительными, позволит произвести повторное осеменение не супоросных животных.

Важнейшим компонентом успешного искусственного осеменения является высокое качество спермы, которая используется в нужное время в нужном месте. Тщательная обработка спермы, понимание физиологии репродуктивных органов свиней, выбор времени для выявления охоты, а также хорошая технология осеменения имеют большое значение. За получением компетентных советов обращайтесь к экспертам.

Надеемся, что практические советы, изложенные в данной статье, помогут Вам выработать навыки криоконсервации и размораживания спермы и быть во всеоружии при проведении искусственного осеменения в Вашем хозяйстве.



Статистика

Вверх

© Ветеринария 2016