История развития бактериофагии, как одного из направлений микробиологии, уходит далеко в прошлое. Первые сообщения о растворении микроорганизмов появились в конце XIX - начале XX столетия. В 1898 г. русский ученый

Н.Ф. Гамалея обнаружил, что при обработке дистиллированной водой бацилл сибирской язвы выделяется специфическое вещество, которое обусловливает просветление взвеси сибиреязвенных палочек и растворяет свежевыра- щенную культуру. Это специфическое вещество исследователь назвал бактериолизином и высказал мнение, что оно образуется бактериями при их распаде. Однако недостаток материала не позволял ему сделать окончательный вывод об этом феномене. Оставалась без внимания и работа F. Twort (1915), который при посеве оспенного детрита на агар обнаружил среди колоний белого стафилококка стекловидные колонии. Фильтрат из последних, разведенный 1:6, давал стекловидные колонии в свежевыращенной стафилококковой культуре. Автор предполагал, что действующим началом является новая форма, более низкоорганизованная по сравнению с бактериями, она могла быть живой протоплазмой или энзимом, способными возникать и размножаться эндогенно.

В последующие годы канадский микробиолог Д'Эрелль (1915, 1927, 1935) опубликовал обширные материалы, привлекшие всеобщее внимание к феномену растворения микробов. Ученый обнаружил в фильтрате из испражнений выздоравливающего больного, страдающего тяжелой формой дизентерии Шига, вещество, которое при пересеве растворяло свежевыделенную культуру палочки Шига, при этом активность вещества при пересевах увеличивалась. На основании проведенных исследований Д'Эрелль создал новую, весьма привлекательную теорию о том, что наблюдаемое им растворение дизентерийных бактерий вызывается не веществом, а живым существом, ультрамикроскопическим паразитом бактерий, невидимым в обычном микроскопе даже при самом сильном увеличении. Образуемые им стерильные пятна на газоне агаровой культуры, по представлению исследователя, есть ничто иное, как колонии размножившихся живых существ, которых он назвал бактериофагами, что в переводе с греческого означает «пожиратели бактерий». Это название используется до настоящего времени, хотя оно и не отвечает в полной мере современным представлениям о природе фага и его взаимодействии с бактериями, отражая лишь видимую невооруженным глазом одну из сторон этого сложного процесса - лизис микробной клетки. В специальной литературе наряду с указанным термином можно встретить наименования: фаг, вирус бактерий или просто вирус, фаговые частицы или корпускулы, бляшкообразующие единицы (БОЕ).

После открытия явлений бактериофагии Д'Эрелль развил учение о том, что бактериофаги патогенных бактерий, являясь их паразитами, играют большую роль в патогенезе инфекций, обеспечивая выздоровление больного организма, а затем - создание специфического иммунитета. Это положение и привлекло к явлению бактериофагии внимание многочисленных исследователей, которые предполагали найти в фагах важное средство борьбы с наиболее опасными инфекционными болезнями человека и животных.

В бывшем СССР одним из центров бактериофагии стал Институт бактериологии, позднее переименованный в Институт вакцин и сывороток, а в настоящее время - Тбилисский институт бактериофагии, микробиологии и вирусологии. Он был основан в 1923 г. профессором Г. Эли- ава, который в 1918 г., независимо от Д'Эрелля, обнаружил в воде реки Куры бактериофаги, активные в отношении холерного вибриона. Эти наблюдения явились причиной его встречи с ДЗреллем в Париже в начале 1920-х годов и решения дальнейшего изучения данного вопроса.
В начале 1930-х годов Д'Эрелль дважды приезжал в Тбилиси. В результате общения этих двух ученых была намечена программа по изучению бактериофагов путем создания Всемирного центра бактериофагии.

В настоящее время известны фаги почти у всех видов патогенных и сапрофитных бактерий.

Всесторонние исследования по изучению бактериофагов, выполненные за последние 40- 45 лет, позволили широко использовать их для решения многих задач в микробиологии, вирусологии, генетике, биохимии, иммунологии, радиобиологии, биотехнологии и других областях биологии. Поэтому бактериофагия, развивающаяся вначале как узкая область медицинской микробиологии, в настоящее время приобрела общебиологическое значение.

Исследования с использованием фагов позволили раскрыть механизмы таких фундаментальных биологических процессов, как репликация ДНК, рекомбинация, транскрипция и генная регуляция. Благодаря изучению фагов открылись также возможности разработки многих важных методов и направлений генной инженерии.

С помощью фагов проводятся широкие радиобиологические исследования, а также первичный отбор химиотерапевтических средств и некоторых антибиотиков против вирусных болезней и злокачественных опухолей.

Фаги используют для важнейших биологических исследований космического пространства.

В ветеринарии и медицине практическое использование фагов связано с изучением наследственной изменчивости бактерий (трансдукция, фаговая конверсия), индикацией и идентификацией патогенных бактерий, фаготерапией и фагопрофилактикой.

Однако в течение двух последних десятилетий преобладало мнение, что изучение фагов уже не может дать науке ничего принципиально нового. В России в момент возникновения генной инженерии произошел резкий отход от изучения фагов в пользу лучше финансируемых исследований. Лишь несколько лабораторий в России продолжают до настоящего времени фундаментальные исследования фагов. По мнению большинства специалистов-фагологов, очевидно, что отход от исследования фагов был необоснованным. Так, несмотря на накопленный научный материал по изучению биологических свойств бактериофагов, многие вопросы требуют дополнительных исследований. Например, у большинства, как считалось ранее, прекрасно изученных модельных эшерихиозных фагов Т-серии, несмотря на 40-летний период напряженных исследований, так и не удалось выяснить функцию двух третей продуктов. Кроме этого, нет единой схемы таксономии и морфологической классификации этих микроорганизмов, отсутствуют стандартные наборы бактериофагов многих возбудителей заболеваний животных и человека, а также схемы и параметры их применения.

Интерес к фагам возродился недавно по ряду причин. Прежде всего, вспомнили о возможностях фаготерапии в связи с появлением множественно-устойчивых к антибиотикам возбудителей болезней. В настоящее время в результате молекулярно-генетических исследований была обнаружена связь генома патогенности бактерий с профагом и, наконец, предположена возможность генетического обмена не только между бактериями и фагами, но и между фагами и эукариотами (В. Н. Крылов, 2003).

Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы УГСХА определила одно из приоритетных научных направлений - выделение и изучение бактериофагов. На кафедре в сотрудничестве с ведущими научными центрами страны (ВНИИВСГЭ, ВГНКИ, ВНИИЗЖ, ВНИИВиМ) более тридцати лет ведется научно-исследовательская работа по этой проблеме, в частности, изучение бактериофагов малоизученных в ветеринарии энтеробактерий.

Выбор этого научного направления связан с тем, что в последние годы, благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей, расширилось представление об этиологическом значении бактерий семейства Enterobacteriaceae в патологии животных и человека. Представители этого семейства широко распространены в природе и большинство из них является нормальной микрофлорой желудочно-кишечного тракта животных и человека. Однако среди этих микроорганизмов имеются патогенные рода, виды и варианты, способные вызывать у животных и людей как самостоятельные заболевания (эшерихиоз, сальмонеллез, иерсиниоз, клеб- сиеллез и др.), так и энтериты, нагноение ран, абсцессы, маститы, эндометриты, менингиты, пневмонии, сепсис и т. п., пищевые и кормовые токсикозы и токсикоин-фекции и др.

Особого внимания заслуживают работы разных исследователей по изучению роли этих микроорганизмов в этиологии желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных, которые продолжают представлять большую проблему, имеют повсеместное распространение и наносят огромный экономический ущерб животноводческим хозяйствам, особенно крупным фермам.

Долгое время, особенно в период 1960г - 1980-х годов минувшего столетия, почти все заболевания новорожденных животных с клиническими симптомами диареи относили к незаразным функциональным болезням, называемым диспепсиями, несмотря на наличие всех признаков эпизоотического процесса. Хотя уже тогда в мероприятиях по лечению и профилактике этих «диспепсий» присутствовали меры, направленные на микробный агент и разрыв эпизоотической цепи (применение антибактериальных препаратов, дезинфекция, периодическая смена помещений на основе принципа «все пусто - все занято» и др.).

К настоящему времени накоплен огромный фактический материал, свидетельствующий о том, что в преобладающем большинстве случаев желудочно-кишечные заболевания молодняка животных имеют инфекционную природу и обусловлены разнообразными агентами. Особое место в этиологии заболеваний новорожденных животных занимает так называемая «стойловая» условно-патогненная микрофлора, которая, в отличие от возбудителей «классических инфекций», ежедневно поступает с экскрементами клинически здорового маточного поголовья (животных-бактерионосителей), а при возникновении первых случаев болезни - с фекалиями больного молодняка в помещения, где рождаются животные и проводится их выращивание в первые недели жизни.

К такой микрофлоре, наряду с некоторыми другими микроорганизмами, относятся бактерии семейства Enterobacteriaceae, знания о которых как возбудителях заболеваний животных и человека в последние десятилетия расширились благодаря работам многих исследователей.

До начала 90-х годов прошедшего столетия ветеринарные лаборатории нашей страны бактериологические исследования патологического материала от больного и павшего молодняка животных сводили к выявлению в нем только патогенных эшерихий и сальмонелл, не принимая во внимание наличия представителей других родов семейства Enterobacteriaceae ввиду отсутствия нормативных документов по диагностике болезней, вызываемых этими микроорганизмами. Они были впервые разработаны и утверждены в конце 1991 года. (Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями) и затем переработаны в 1999 году, согласно этим документам бактерии родов Proteus, Morganella, Citrobacter, En-terobacter, Klebsiella, Yersinia и др. получили официальное признание возбудителей болезни.

В конце прошлого и в начале настоящего века также было установлено, что диарею у молодняка животных с признаками геморрагического гастроэнтерита, а также отечную болезнь у поросят могут вызывать штаммы эшерихий серо- группы 0157 (серовары 0157: Н7 и 0157Н-), считавшиеся ранее непатогенными для животных (О. А. Тугаринов, М. К. Пирожков, Ю. А. Малахов, 2001; С. Н. Золотухин, JI. С. Каврук, Д. А. Васильев, 2005).

Контаминируя пищевое сырье и продукты питания, вышеперечисленные энтеробактерии представляют опасность и для людей, вызывая у них тяжело протекающие токсикоинфекции.

Эффективность лечебных мероприятий во многом зависит от своевременной диагностики болезни, поэтому совершенствованию методов лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых патогенными представителями энтеробактерий или протекающих с их участием, уделяется большое внимание.

При постановке диагноза бактериологическим методом существует ряд трудностей. Одна из них состоит в том, что основой идентификации этих бактерий являются их биохимические свойства. Трудоемкость и длительность изучения ферментативных свойств не позволяет быстро и точно идентифицировать названные микроорганизмы. Современные методы лабораторной диагностики (ПЦР, ИФА, РИА), которые могут быть использованы для этих целей, хотя и являются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов для постановки этих реакций делает их пока недоступными для большинства ветеринарных лабораторий.

В связи с этим возникла необходимость в поиске альтернативных методов лабораторной диагностики, которые были бы менее трудоемкими, более быстрыми и доступными. Одним из таких методов является фагодиагностика. Методы фагодиагностики, разработанные в середине прошлого века, являются специфичными, не требует больших затрат времени, материалов и доступны лабораториям всех уровней.

Ввиду отсутствия в нашей стране стандартных наборов фагов для диагностики заболеваний, вызываемых патогенными энтеробактериями, одной из задач наших исследований явилось выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов, конструирование из них диагностических препаратов и разработка методов их практического применения.

В результате исследований проб сточных вод, фекалий животных, воды открытых водоемов, патологического материала от больных и павших телят и поросят нами было выделено и селекционировано более 130 изолятов фагов, лизирующих штаммы патогенных для животных и человека энтеробактерий следующих родов: Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Providencia, видов: Yersiniaenterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Morganella morganii и E. coli серогруппы 0157 (сероваров 0157: H7 и 0157Н-). Ведется поиск новых изолятов фагов, активных в отношении бактерий родов Pseudomonas, Aeromonas, Pasterella, Enterococcus, Serratia и др., представители которых имеют этиологическое значение в патологии животных и могут вызывать пищевые токсикоинфекции у людей.

У выделенных фагов изучены основные биологические свойства. Определено классификационное положение изученных изолятов согласно современной классификации и таксономии вирусов (С. Н. Золотухин, Д. А. Васильев, J1. С. Каврук и др., 2005).

Четырнадцать перспективных штаммов фагов (Phagum Morganella morganii М17 УГСХА - ДЕП., Phagum Morganella morganii M20 УГСХА - ДЕП., Phagum Escherichia coli 0157 E-61 УГСХA - ДЕП., Pagum Escherichia coli 0157 E-67 УГСХА - ДЕП., Phagum Citrobacter С-61 УГСХА - ДЕП., Phagum Citrobacter С-66 УГСХА- ДЕП.,Phagum Citrobacter С-52 УГСХА - ДЕП., Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА-ДЕП., Phagum Proteus П-16 УГСХА-ДЕП., Phagum Proteus П-261 УГСХА-ДЕП., Phagum EnterobacterEn-2 УГСХА- ДЕП., Phagum Enterobacter En-13 УГСХА-ДЕП., Phagum KlebsiellaK-10 УГСХА-ДЕП., Phagum Klebsiella K-81 УГСХА-ДЕП.) депонированы в ВГНКИ ветеринарных препаратов и рекомендованы для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

С использованием строгой специфичности селекционированных бактериофагов, нами разработаны методы идентификации вышеперечисленных энтеробактерий, которые позволяют определить родовую, видовую и даже серогрупповую принадлежность выделенной культуры микроорганизмов без изучения ферментативных и серологических свойств в течение 48 часов вместо 5-7 суток, что позволяет значительно сократить сроки и затраты на диагностические исследования.

Ускоренное обнаружение возбудителя болезни в патологическом материале, кормах, пищевых продуктах и объектах внешней среды рекомендуем проводить при помощи реакции нарастания титра фага (РНФ) с использованием тех же наборов бактериофагов.

Сущность РНФ заключается в том, что если в исследуемом материале присутствует искомый возбудитель заболевания, то добавленный к такому материалу гомологичный фаг, вступая во взаимодействие с ним, интенсивно размножается, и последующее увеличение концентрации свободного внеклеточного фага указывает на присутствие в исследуемом субстрате гомологичного возбудителя.

РНФ с применением предлагаемых нами наборов фагов по технике выполнения является простым, чувствительным и специфическим методом диагностики, позволяющим за относительно короткий срок (11-22 ч.) обнаружить искомые бактерии в концентрации 102-104 микробных клеток в 1 г (мл) исследуемого материала в присутствии посторонней микрофлоры, без выделения чистых культур энтеробактерий. Бактериологическим методом такую концентрацию микроорганизмов обнаружить, как правило, не удается.

Диагностические исследования рекомендуем проводить в соответствии с разработанными нами методиками, изложенными в семи методических рекомендациях по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий родов Klebsiella, Citrobacter, Proteus, Enterobacter, видов Morganella morganii, Yersinia enterocolitica и энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157: Н7 и 0157Н - в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утвержденных отделением ветеринарии РАСХН (2004, 2006).

К сожалению, биологическая промышленность страны в настоящее время не изготовляет специфических средств для профилактики и терапии кишечных инфекций, вызываемых вышеперечисленными энтеробактериями или протекающих с их участием (за исключением эшерихиозных вакцин и сывороток), что существенно снижает эффективность мероприятий по борьбе с этими заболеваниями.

Применение антибиотиков и нитрофурано- вых препаратов для лечения и профилактики инфекционной диареи молодняка в ряде случаев не дает ожидаемого положительного результата, что связано с приобретением устойчивости условно-патогенных микроорганизмов к 3-5 и более антибиотикам. Об этом свидетельствуют результаты наших исследований (С. Н. Золотухин, 2002, 2004), которые согласуются с литературными данными многих отечественных и зарубежных авторов (Е. С. Воронин и др., 1989; Е. Т. Парайко, 1990; М. Barben, P. Н Waer-Worth, 1964; Н. Trollenir, 1980; Р. М. Hawekey и др., 1983). Первые попытки использовать бактериофаги для лечебно-профилактических целей были предприняты в медицине. В литературе имеются сообщения, свидетельствующие о положительном лечебно-профилактическом действии препаратов бактериофагов при использовании их во время эпидемии холеры, при дизентерии и других желудочно-кишечных болезнях.

Отдельные попытки использования различных бактериофагов при инфекционных болезнях животных были предприняты еще в 1920-30-х годах. ДЗрелль (1928, 1935) пытался использовать фаги при пуллорозе-тифе у кур. В связи с возрастанием уровня устойчивости возбудителей болезни к антибиотикам и отрицательным влиянием последних на организм животных, а через продукты питания и на человека, фаготерапия и фагопрофилактика инфекционных заболеваний вновь стала привлекать к себе внимание многих исследователей.

Поэтому разработка и изготовление лечебно-профилактических фаговых препаратов для нужд ветеринарии в настоящее время приобретает большую актуальность для практики. Преимуществом этих средств является их экологическая безопасность, безвредность, даже в больших дозах, и отсутствие побочных действий на организм животных (дисбактериоза, аллергических реакций, угнетения функций иммунной системы). В то же время фаготерапия и фагопрофилактика не исключают применения симптоматического лечения, серотерапии и серопрфилактики, пробиотиков, антибиотико- терапии, вакцинопрофилактики, а также всего комплекса ветеринарно-санитарных и зоогигие- нических мероприятий.

В настоящее время мы изучаем возможность применения бактериофагов для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных, а также ликвидации скрытого бактерионосительства. Ведутся научные исследования по разработке технологических параметров получения и контроля новых биопрепаратов, подбор оптимальных дозировок, схем и способов их применения.

Для этих целей используем выделенные и селекционированные нами изоляты фагов выше-перечисленных энтеробактерий из коллекции УГСХА в различных комбинациях, в зависимости от этиологии заболевания и чувствительности к ним идентифицированных возбудителей болезни, циркулирующих на конкретной ферме.

С целью повышения эффективности научно- исследовательской работы в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии в 2006 г. с использованием материально-технической, научно-методической базы и кадрового потенциала кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы создан Научно-исследовательский центр микробиологии и биотехнологии, одним из структурных подразделений которого является лаборатория экспериментальной микробиологии и бактериофагии.

Авторы:  С. Золотухин, канд. вет. наук, проф., Д. Васильев, д-р биол. наук, проф., А. Мелехин, вет. врач, Е. Бульканова, Н. Феоктистова, Б. Пожарникова, аспиранты ФГОУ "Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия".

Статистика

Вверх

© Ветеринария 2016